Muss für ein rekombinantes pUC19-Plasmid mit Schnittstellen bei Hind III und EcoO109i Lactose vorhanden sein, damit das interessierende Gen exprimiert wird?

Ich züchte E. coli transformiert mit dem Plasmid pUC19 mit einem Insert eines Enzyms im Rattenhirn zwischen den erwähnten Schnittstellen ( Eco O109i und HindIII ). Ich habe das rekombinante Molekül mit kundenspezifischer Gensynthese isoliert und erzeugt, so dass das Gen, das für das Enzym kodiert, leicht in das Plasmid ligiert. Es ist nach dem Lac-Promotor und dem Lac-Operator, also brauche ich Laktose im Wachstumsmedium, damit das Enzym hergestellt werden kann?

Warum würden Sie das gesamte lacZ- Operon herausschneiden, anstatt das MCS zu verwenden? Wer weiß, wie gut die Expression Ihres Zielgens ohne die vom Operon exprimierte Maschinerie funktionieren wird?
@MattDMo lacZ ist ein einzelnes Gen, kein Operon. Der einzige negative Effekt, den ich mir vorstellen kann (unter der Annahme, dass es keine Probleme beim Entfernen des Fragments zwischen lacZ und ampR gibt ), ist die Unfähigkeit, mit dem Plasmid ein Blau-Weiß-Screening durchzuführen.

Antworten (1)

Ich würde eher das synthetische Analogon IPTG zur Induktion von Genen hinter einem lac-Promotor verwenden, da sie nicht abgebaut werden (oder zumindest viel langsamer als Laktose) und daher ein viel stärkeres Induktionssignal geben.

Sie müssen die optimale IPTG-Konzentration testen, aber als Ausgangspunkt würde ich eine Endkonzentration von 1 mM verwenden. Wenn dies nicht optimal ist (zu viel unlösliches Protein oder nicht genug), können Sie die Konzentration in beide Richtungen ändern. Verwenden Sie zu Beginn eine Übernachtkultur, um morgens eine frische Kultur zu inokulieren, und verfolgen Sie die OD 600 bis sie 0,6–0,8 erreicht, bevor Sie das IPTG hinzufügen.

Muss für ein rekombinantes pUC19-Plasmid mit Schnittstellen bei Hind III und EcoO109i Lactose vorhanden sein, damit das interessierende Gen exprimiert wird?
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