Der AcGFP1-Vektor kann selbst Licht emittieren, während im Falle des Luc-Vektors ein Substrat für die Reaktion benötigt wird. Trotzdem soll Luc spezifischer oder besser als AcGFP1 sein. Warum heißt das so? Was sind die Vorteile von Luc-Vektoren gegenüber AcGFP1?
Du verwechselst Lumineszenz und Fluoreszenz. GFP emittiert kein Licht. Die Abkürzung steht für Green Fluorescent Protein. Sie müssen eine blaue Lichtquelle darauf richten und es wird grün fluoreszieren. Das Problem ist, dass viele Organismen eine Hintergrundfluoreszenz haben, eine Zelle ohne GFP kann oft selbst ein wenig fluoreszieren oder Pigmente enthalten, die das Signal maskieren.
Luciferase-Assays hängen von einer chemischen Reaktion ab, bei der ein Molekül (Luciferin im Fall von Glühwürmchen-Luciferase) oxidiert wird und Photonen emittiert werden. Dies ist viel empfindlicher als Fluoreszenz, aber auch viel teurer und erfordert normalerweise (aber nicht immer) eine Zelllyse. Es ist sehr selten, dass eine Zelle selbst Licht emittiert, sodass der Hintergrund viel niedriger ist, sodass Sie kleinere Unterschiede sehen können.
Es gibt viele Gründe, in einem Assay einen dem anderen vorzuziehen. Wenn Sie etwas mehr darüber erzählen, wie Sie den Reporter verwenden möchten, können Sie eine detailliertere Antwort erhalten.
Der zu verwendende Vektor hängt davon ab, was Sie tun möchten.
Die möglichen Probleme mit GFP sind:
Der Funktionsverlust des Fusionsproteins (Sie fügen Ihrem Protein 238 Aminosäuren hinzu, das ist eine ziemlich große Veränderung!). Es gibt Vektoren, die eine Fusion in C- oder N-ter Ihres Proteins ermöglichen, um dies zu vermeiden.
Das GFP kann sich von seinem Fusionsprotein trennen, wodurch Beobachtungen oder Immunpräzipitationen nutzlos werden.
Bei einem Vektor mit hoher Expression kann es zu einer Fluoreszenzsättigung in Ihren Zellen kommen, sodass eine Quantifizierung schwierig wäre.
Beim Luciferase-Assay fügen Sie das Substrat hinzu, damit Ihre Quantifizierungen erfolgen können, sobald die Reaktion beginnt, und Luminometer sind empfindlich genug, um eine sehr niedrige Luc-Aktivität zu erkennen oder sehr wenige Zellen zu verwenden.
ABER
Mit GFP-Vektoren können Sie In-vivo-Assays durchführen (Quantifizierung, intrazelluläre Lokalisierung, Zellsortierung...), während Luc-Assays die Lyse Ihrer Zellen benötigen. Abhängig von Ihrem Ziel ist es also besser, das eine oder andere System zu verwenden.