Wie kann verhindert werden, dass sich während der Ligation eine alte Promotorregion anstelle einer neuen an ein Plasmid anlagert?

Ich versuche, eine vorhandene Promotorregion in einem Plasmid herauszunehmen und durch eine neue zu ersetzen. Also verwende ich zuerst die entsprechenden Restriktionsenzyme, um die vorhandene Promotorregion loszuwerden. Als nächstes füge ich das neue Promotorfragment hinzu, das die entsprechenden klebrigen Enden hat, und dann möchte ich den neuen Promotor durch Ligation in das Plasmid platzieren.

Da die alte Promotorregion und die neue Promotorregion die gleichen "klebrigen Enden" haben, wie verhindere ich, dass die alte Promotorregion während der Ligation in das Plasmid anstelle der neuen platziert wird?

Die Durchführung der Ligation und Sequenzierung von 5–10 Klonen ist eine Option. Sie brauchen nur einen Klon mit dem "neuen" Promotor, der der Ligation im Überschuss hinzugefügt wird, oder?

Antworten (1)

  1. Führen Sie es nach dem Verdau auf einem Gel aus und extrahieren Sie nur den Vektor.

  2. Nach der Verdauung mit einer Phosphatase behandeln. Dies verhindert eine Religation, da Sie mindestens eines Ihrer Fragmente phosphorylieren müssen, damit die Ligation funktioniert.

  3. (Auf jeden Fall ein Muss) mehrere Kolonien am Ende sequenzieren.

Ich empfehle, alle drei zu machen.

Bearbeiten: Option 4: Verdau mit einem dritten Enzym, das Ihren alten Promotor einschneidet, aber nicht den Vektor oder den neuen Promotor.

Wenn Ihr neuer Promotor kurz ist und Sie ein Paar Oligos mit klebrigen Enden verwenden, die nicht geschnitten werden müssen, sollten Sie die Oligos entweder mit Polynukleotidkinase phosphorylieren oder den Vektor nicht dephosphorylieren. Sie müssen das eine oder andere phosphorylieren, damit die Ligation funktioniert. Außerdem ist das Pflücken vieler Kolonien obligatorisch. Normalerweise mache ich 24 Minipreps gleichzeitig, weil das in die Zentrifuge passt. Machen Sie so viele wie möglich. Es gab viele Fälle, in denen nur 1 Miniprep erfolgreich war. Apropos, haben Sie eine gute Möglichkeit zum Screening, Sie brauchen schöne, klare Ergebnisse.
Also, um zu bestätigen, sobald ich die alte Promotorregion losgeworden bin, lasse sie auf einem Gel laufen, um das "geöffnete Plasmid ohne Promotorregion" zu isolieren. Sobald ich das habe, führe ich eine Ligation mit der neuen Promotorregion durch ....
Auf dem Plasmid werde ich amp haben. Resistenzgens, um die erfolgreich transformierten Bakterien zu verfolgen.
@RadekMartinez Ja, Sie beschreiben das Standard-Klonverfahren, Ausschneiden, Einfügen, nach guten Plasmiden suchen. Was ist Ihr neuer Promoter? Wie groß ist es?
Ich bin mir noch nicht sicher. Es ist jedoch nicht wie 20 - 30 bp, viel größer.
Wie kann verhindert werden, dass sich während der Ligation eine alte Promotorregion anstelle einer neuen an ein Plasmid anlagert?
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