Welche Rolle spielt tracrRNA in CRISPR-cas9?

Ihre beiden Fragen hängen zusammen und Sie haben Recht mit Ihrer Vermutung, dass das Cas9-Protein mit einer bestimmten RNA-Sequenz assoziiert ist. Die der tracrRNA wird mit der crRNA zu einer gRNA verarbeitet. Dies wird ohne weitere Hilfsmittel erreicht, so dass dies automatisch erfolgen könnte. Wie spezifisch die tracrRNA-Sequenz sein muss, ist eine interessante und oft übersehene Frage.

Beim Vergleich von tracrRNA aus verschiedenen Arten ist klar, dass es nicht viel Sequenzkonservierung gibt, aber es wird vorhergesagt, dass sie ähnliche Sekundärstrukturen enthalten.

Das Abgleichen von tracrRNA und Cas9 von eng verwandten Arten führt zwar zu einer in vitro DNA-Spaltung, aber dies funktioniert nicht mit entfernter verwandten Arten. Nichtsdestotrotz sind sie bemerkenswert vielseitig, und dies wurde in einer Reihe spannender genomtechnischer Anwendungen ausgenutzt, bei denen zusätzliche Strukturen hinzugefügt werden, ohne die Bindung der RNA an Cas9 zu beeinträchtigen.

Die tracrRNA und die crRNA bilden zusammen die gRNA, die das Cas9-Protein zum Ort der Spaltung lenkt. In den endogenen bakteriellen Systemen nimmt die gRNA die Form eines prozessierten RNA-Duplex an, aber in den Genom-Editing-Implementierungen nimmt dies die Form einer einzelnen chimären RNA an, bei der die beiden Komponenten bereits miteinander verschmolzen sind.

Wenn es um die tatsächliche Spaltung von DNA geht, ist es wichtig, dass das Cas9 in der richtigen Konformation vorliegt und Änderungen in dieser bekanntermaßen auftreten, wenn es an die Ziel-DNA bindet. Jüngste Arbeiten deuten darauf hin, dass die tracrRNA eine Rolle dabei spielt, das Cas9-Protein in einer aktiven Form zu halten, die es ihm ermöglicht, auf DNA zu zielen.

Es trägt wahrscheinlich auch zur Gesamtstabilität (und damit zur Effizienz) des CRISPR-Cas9-Komplexes bei.

Letztendlich ist die tracrRNA eine wesentliche Komponente des CRISPR-Cas9-Systems, da sie sowohl das Cas9-Protein zu seinem Ziel führt als auch seine Funktion unterstützt.

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Strukturelle Rollen von Leit-RNAs in der Nukleaseaktivität von Cas9-Endonuklease

Kurz gesagt, tracrRNA hält den CRISPR-Cas9-Komplex (aus RNA und dem Cas9-Protein) katalytisch aktiv:

^{Bildquelle: Abbildung 5 von Lim, Y. et al., 2016. Strukturelle Rollen von Leit-RNAs in der Nukleaseaktivität der Cas9-Endonuklease. Nature Communications, 7, S. 13350. Verfügbar unter: http://dx.doi.org/10.1038/ncomms13350 .}

Dies wurde gezeigt, indem verschiedene Sätze von Komponenten zusammen 20 Minuten lang vorinkubiert wurden, dann die fehlende(n) Komponente(n) hinzugefügt und die resultierende Menge an DNA-Spaltungsaktivität beobachtet wurde. Zum Beispiel werden im "rosa" Experiment nur das Cas9-Protein und die tracrRNA zusammen vorinkubiert und die crRNA wird kurz vor der 5-minütigen Spaltzeit hinzugefügt:

^{Bildquelle: Abbildung 1 von Lim, Y. et al., 2016. Strukturelle Rollen von Leit-RNAs in der Nukleaseaktivität der Cas9-Endonuklease. Nature Communications, 7, S. 13350. Verfügbar unter: http://dx.doi.org/10.1038/ncomms13350 .}

Der grüne Balken stellt das Cas9-Protein dar, das 20 Minuten lang sowohl mit der tracrRNA als auch mit der crRNA vorinkubiert wurde. Der rosafarbene Balken zeigt, dass die Vorinkubation mit tracrRNA, aber ohne crRNA, immer noch zu demselben Aktivitätsniveau führt (gemessen als Bruchteil des gespaltenen Produkts). Wenn die tracrRNA jedoch nicht in die Vorinkubation einbezogen wird, wie in den gelben und blauen Experimenten, ist die Aktivität stark reduziert.