LacZ'-Selektion: blaue Kolonien trotz Ligation des Inserts

Es wurde vermutet, dass Bakterien, die mit dem pBlueScript-Vektor transformiert wurden, der ein Insert in der Mitte des lacZ'-Gens enthält, auf X-Gal immer noch eine blaue Farbe abgeben können, wenn das Insert klein und im Leserahmen mit dem lacZ'-Gen ligiert ist (Quelle : mein Kurs, ResearchGate ).

Ich verstehe nicht, wie es möglich ist, dass die Übersetzung nicht an dem durch das Insert codierten Stoppcodon endet. Hat das etwas mit Leaky Termination zu tun? Selbst wenn ein Leckabschluss möglich wäre, würde dies außerdem bedeuten, dass IMMER eine Wahrscheinlichkeit von 1 zu 3 besteht, dass sich die Einfügung im Rahmen befindet.

Die Transkription endet nicht am Stoppcodon.
@Kanadier Danke! Aber warum nicht? Und wenn es nicht am Stoppcodon stoppt, bedeutet das nicht auch, dass in 1 von 3 Fällen ein Insert in-frame ligiert würde und der Assay nicht funktionieren würde?
Transkription hat nichts mit Codons zu tun. Vielleicht meintest du die Übersetzung?
@canadianer Hoppla, das ist umständlich! Ja, das meinte ich!

Antworten (1)

Die meisten Inserts unterbrechen die Beta-Gal-Expression (durch Verschieben des Leserahmens und Einführen von Stoppcodons) und entfernen daher die enzymatische Aktivität, die erforderlich ist, um X-Gal zu spalten und die blaue Farbe zu erzeugen.

Ihre Quelle stimmt Ihnen zu - das Einfügen eines Stoppcodons stoppt die Übersetzung (nicht die Transkription) und behält die weiße Farbe.

Danke! Aber die Quelle sagt auch, dass "in seltenen Fällen, wenn das Insert sehr klein ist und den Leserahmen nicht stört, die Beta-Galactosidase-Aktivität sogar in den rekombinanten Klonen auftritt, so dass das Blau-Weiß-Screening irrelevant wird." Interpretiere ich das falsch?
Ich verstehe die Implikation, dass das Insert kein Stoppcodon haben muss, um immer noch Beta-Galactosidase-Aktivität zu haben. Ich denke, das ist vernünftig, weil der Stop-Codon-Fall explizit im vorherigen Absatz angesprochen wird.
Aber bedeutet dies nicht, dass ohne Stoppcodon in 1 von 3 Fällen blaue Farbe erzeugt wird (Wahrscheinlichkeit einer Ligation im Rahmen) und der Assay irgendwie sinnlos ist, also warum sollte ihn jemand so verwenden?
Das Insert muss die Proteinfaltung nicht stören, zusätzlich dazu, dass es klein ist, kein Stoppcodon hat und sich im Leserahmen befindet.
@mxwsn Sie sollten dies Ihrer Antwort hinzufügen.
LacZ'-Selektion: blaue Kolonien trotz Ligation des Inserts
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