Können Bakterien dephosphorylierte Plasmide reparieren?

Ich habe versucht, eine kurze DNA-Sequenz in ein Plasmid einzufügen. Ich wollte zwei verschiedene Versionen machen, mit dem Einsatz an verschiedenen Stellen. Ich wählte auf dem Plasmid ungefähr einander gegenüberliegende HinDIII- und SalI-Stellen und entwarf Oligos mit HinDIII- oder SalI-Stellen und natürlich zusätzlichen Basen an den Enden, um ein richtiges Schneiden zu ermöglichen.

Ich habe die Plasmide und Oligos geschnitten und den Vektor dephosphoryliert, um leere Vektorligationen zu verhindern. Ich habe Plasmid und Oligos gemischt und ligiert, dann in Bakterien transformiert, alles Standardmaterial.

Die HinDIII-Version funktionierte beim ersten Mal, mit wenigen Kolonien auf der leeren Vektorkontrollplatte und mehr Kolonien auf den Platten, die während der Ligation Oligos erhielten. Ich bestätigte die Insertion, indem ich die BpmI-Schnittstelle verwendete, die die Oligos gerade zufällig trugen.

Die SalI-Version ist jedoch jedes Mal fehlgeschlagen, wenn ich sie ausprobiert habe. Die leere Vektorkontrolle und alle anderen Platten sind nur ein Teppich aus Zellen. Es gibt sehr wenige einzelne Kolonien, und die vorhandenen sehen nicht richtig aus, zu klein. Ich habe noch nicht einmal einen Miniprep ausprobiert, zu wahrscheinlich, um einen leeren Vektor zurück zu bekommen. Ich habe eine nicht transformierte Kontrolle durchgeführt, bei der die Zellen keine DNA erhielten und nur direkt ausplattiert wurden. Diese Zellen starben, was darauf hindeutet, dass es kein Problem mit meinem Ampicillin ist.

Meine Hypothese ist, dass unligierte leere Vektoren den korrekt ligierten Plasmiden zahlenmäßig überlegen sind und dass Zellen, die eine Kopie der unligierten DNA aufnehmen, den Schnitt irgendwie reparieren, obwohl er dephosphoryliert ist. Dies wird wahrscheinlicher, da ich nur einen einzelnen Verdau verwendet habe, sodass das Plasmid übereinstimmende klebrige Enden aufweist, die HinDIII-Version jedoch dieselbe Strategie verwendete. Ich habe eine 1-stündige Inkubation in SOC-Medien bei 37 °C eingeschlossen, was den Bakterien mehr Zeit geben könnte, diese Reparatur durchzuführen. Wenn ich die Inkubation überspringe, würde das vielleicht unerwünschte Reparaturen verhindern.

Ich teste diese Hypothese mit einigen zusätzlichen Kontrollen, einschließlich der Transformation von Bakterien mit leerem Vektor, der nicht mit Ligase behandelt wurde, um sicherzustellen, dass die Ligationsreaktion nicht das Problem ist, sowie der Verwendung der zuvor ligierten DNA ohne die SOC-Inkubation. Ich werde diese Daten melden, sobald sie verfügbar sind. Mir fehlen kompetente Zellen, also kann ich im Moment nicht viel anderes tun.

Was halten Sie außerdem davon, die ligierte DNA mit Klenow zu behandeln, um alle verbleibenden klebrigen Enden vor der Transformation abzustumpfen?

BEARBEITEN: Ich habe die Daten für die Transformationen, die die Ligation und SOC-Medieninkubation übersprungen haben. Das Überspringen der Inkubation änderte nichts, ebenso wenig wie das Überspringen der Ligation. Alle Platten zeigen weiterhin einen Zellteppich.

Ihr Insert hat also an beiden Enden dieselben Seiten – ein ungerichtetes Klonen? Sehen Sie außerdem das linearisierte Plasmid auf dem Gel? Verwenden Sie eine Gelreinigung? Außerdem, wie viel Plasmid haben Sie für den Verdau und die Ligation verwendet?
Es ist tatsächlich ungerichtet. Ich füge nur eine Zinkfinger-Bindungsstelle ein, die Richtung ist mir egal, ich muss nur ein Zinkfinger-Protein, das wir bereits haben, an dieses Plasmid binden. Ich habe bestätigt, dass SalI das Plasmid schneidet, habe aber keine Gelreinigung verwendet. Da es sich um eine einzige Schnittstelle handelt, wäre keine zusätzliche DNA zu entfernen. Ich habe auch nicht jedes Mal, wenn ich das Experiment ausprobiert habe, ein Bestätigungsgel laufen lassen, also könnte das Enzym hypothetisch aufgehört haben zu arbeiten. Die Oligos, die ich hinzufüge, sind kurz, 56 Basen, aber ich nehme an, ein hochdichtes Polyacrylamidgel könnte funktionieren, um dort Schnitte zu sehen.
Aber Sie können das linearisierte Plasmid sehen, wenn Sie eine Gelreinigung durchführen. Sie müssen nicht nach dem Drop-out suchen. Wie bereinigen Sie Ihre Verdauungsreaktion? Nur einfache Säulenreinigung? Es besteht die Möglichkeit, dass Ihr Enzym nicht richtig geschnitten hat. Bakterien können Kerben reparieren, aber ich bin mir nicht sicher, ob sie bevorzugt eine Enzymstelle phosphorylieren. Sie können versuchen, abzustumpfen und sehen, ob das Problem weiterhin besteht.
Ich führe eine Phenol-Chloroform-Reinigung und eine Isopropanol-Präzipitation nach dem Verdau und der Dephosphorylierung sowohl für den Vektor als auch für die Oligos durch. (Ich dephosphoryliere die Oligos offensichtlich nicht) Und wenn ich sage, dass ich den Verdau bestätigt habe, meine ich, ich habe den SalI-Verdau gemacht und ein Gel laufen lassen, und es wurde geschnitten. Es gab einen Abschnitt des Plasmids, bei dem wir uns der Sequenz nicht sicher waren, und ich musste sicherstellen, dass er keine SalI-Stellen enthielt. Ich lasse das Gel nicht jedes Mal laufen, wenn ich das Klonen versuche.
@WYSIWYG Ich denke, du hattest Recht. Ich bin endlich dazu gekommen, es noch einmal zu versuchen, indem ich die Gelreinigung wie empfohlen verwende. Das Gel zeigte, dass das SalI-Enzym das Plasmid nicht sehr gut schnitt, wobei der größte Teil der DNA immer noch in supercoiled-Form und viel als eingekerbte Kreise vorlag. Ich habe die lineare DNA in der Mitte vorsichtig ausgeschnitten und die Kontrollplatte hatte nur 1 Kolonie. Das Problem ist, dass die Versuchsplatten jeweils 2 - 5 Kolonien haben, ich muss sehen, was ich auf Miniprep bekomme. Außerdem waren meine Gelextraktionen schlecht. Wenn ich mit 4 ug DNA beginne, erhalte ich nach der Extraktion weniger als 100 ng DNA.
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Antworten (1)

Gemäß dem Vorschlag von WYSIWYG versuchte ich den Verdau und die Dephosphorylierung erneut mit SalI und ließ ein Gel laufen. Das Gel zeigte, dass SalI beim Schneiden dieses Plasmids weniger als ideal war.Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Wie Sie sehen können, ist die intensivste Bande die untere Bande, bei der es sich höchstwahrscheinlich um supercoiled DNA handelt, wobei die lineare DNA, die ich haben möchte, in der Mitte erscheint und DNA mit offenem Kreis an dritter Stelle steht. Ich habe das mittlere Band sehr vorsichtig herausgeschnitten und eine Gelextraktion durchgeführt. Als ich dies ligierte, hatte die Kontrollplatte 1 Kolonie. Leider hatten die Versuchsplatten jeweils zwischen 2 und 6 Kolonien. Ich führe jetzt Minipreps auf diesen durch, muss nur sehen, was ich bekomme.

Dies erklärt, warum die vorherigen Versuche so viele Kolonien auf den Kontrollplatten erzeugten, dass der größte Teil der DNA ungeschnitten war, sodass kein Maß an Dephosphorylierung helfen würde.

Eine Sache, die mich stört, ist, dass meine Gelextraktionen so aussehen, als hätten sie wirklich schlechte Ausbeuten gehabt. Normalerweise beginne ich einen Verdau mit 4 ug Plasmid. Nach der Phenol:Chloroform-Extraktion und Isopropanol-Präzipitation erhalte ich normalerweise 2 - 3 oder mehr ug DNA. Nach der Gelextraktion habe ich das Glück, 300 ng DNA zu bekommen. Um die Sache noch seltsamer zu machen, geliert die Flüssigkeit, die im letzten Elutionsschritt von der Spinsäule kommt, wie ein Agarosegel mit niedriger Dichte. Die einzige Erklärung, die mir einfällt, ist, dass restliche Agarose in der Spin-Säule irgendwie ihren Weg durch die Membran und in den Elutionspuffer erzwingt. Die Schmiere verstopft Pipettenspitzen und macht das Leben schwer.

SalI ist ein wählerischer Cutter; Ich vermeide es nach Möglichkeit für das routinemäßige Klonen. Da es schlecht schneidet, müssen Sie Gel reinigen, wie Sie festgestellt haben. Stellen Sie sicher, dass Sie überhaupt etwas schneiden, ich bin nicht von Ihrem Gel überzeugt, dass Sie es sind. Verwenden Sie nach Möglichkeit ein alternatives Enzym. Wenn Sie an Ihrer Gelreinigung zweifeln, verwenden Sie ein kommerzielles Produkt, z. B. eine der Qiagen-Säulen (oder Konkurrenten, ich habe keine besondere Bindung zu Qiagen); Sie sind teurer, aber ziemlich zuverlässig. Verschwende deine Zeit nicht mit Transformationen, bis du weißt, dass du eine saubere lineare DNA hast. Viel Glück.
Aus diesem Grund empfehle ich häufig, parallel eine Negativkontrolle mit ungeschnittenem Plasmid durchzuführen, um zu überprüfen, ob Ihre Identifizierung der supercoiled-Bande korrekt ist.
@iayork Ich habe gerade letzte Woche meine Sequenzierungsergebnisse zurückbekommen, und meine "erfolgreichen" Plasmide unterscheiden sich absolut nicht vom ursprünglichen Plasmid. Jetzt, da ich wieder Oligos bestellen kann, denke ich, dass ich eine PCR-basierte Klonierung ohne Verwendung von Restriktionsstellen versuchen werde. Wenn es funktioniert, kann ich die SalI-Probleme vermeiden und habe eine Methode, um die Bindungsstellensequenz an einer beliebigen Stelle einzufügen. Ich konnte es aufgrund seltsamer Regeln mit dem Budget nicht früher tun, wir konnten im letzten Monat des Geschäftsjahres kein Geld ausgeben. Jetzt ist ein neues Geschäftsjahr und ich kann so viele Oligos bestellen, wie ich will.
Budgetfragen sind ärgerlich. Ich kann keine 50 Dollar für eine Grundierung ausgeben, aber es ist in Ordnung, eine Woche Ihrer Zeit zu verschwenden ...
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