Ich habe zwei Plasmide verdaut, eines mit EcoRI und AgeI und das andere mit EcoRI und XmaI. Die Verdaus sahen wie erwartet aus, also reinigte ich die entsprechenden Fragmente und richtete die T4-DNA-Ligation ein (AgeI- und XmaI-Stellen sind kompatibel).
Nach E.coli-Transformation, Kultur und Miniprep aus 12 der resultierenden Kulturen verdaut ich das Isolat aus den Minipreps mit BclI, um zu bestätigen, dass ich das richtige Produkt hatte (weil es eine BclI-Stelle im Insert und eine weitere 1,4 kb entfernt in gab das Rückgrat). Die Ergebnisse dieses Verdaus zeigen deutlich, dass es zwei unterschiedliche Ligationsprodukte gibt: Vier Bahnen teilen ein Bandmuster und die anderen acht teilen ein Muster, das sich davon unterscheidet.
Ich überprüfte beide Plasmide auf andere Restriktionsstellen der verwendeten Enzyme, die ich zuvor übersehen hatte, fand aber keine. Da EcoRI- und XmaI/AgeI-Stellen radikal unterschiedlich sind (AATT vs. CCGG), würde ich die Möglichkeit ausschließen, dass das Insert in umgekehrter Orientierung ligiert wird.
Gibt es neben unbemerkten Restriktionsschnittstellen und reverser Ligation weitere gemeinsame Ursachen für unerwartete Ligationsvarianten?
Könnte Insert-Polymerisation sein. Wenn Sie Ihren DNA-Abschnitt so haben:
(5')-AATTagctagcatcgtgatcgacg-(3')
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(3')-tcgatcgtagcactagcagcGGCC-(5')
Und Sie nehmen das, drehen es um, es wird an sich selbst ligiert, so:
(5')-AATTagctagcatcgtgatcgacg-(3')(5')-CCGGcgacgatcacgatgctagct-(3')
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(3')-tcgatcgtagcactagcagcGGCC-(5')(3')-gctgctagtgctacgatcgaTTAA-(5')
Dies ist leicht genug zu überprüfen. Berechnen Sie einfach die Größe der Fragmente, die Sie von einem Vektor mit zwei Inserts erwarten würden (es gäbe jetzt eine zusätzliche BcII-Schnittstelle, und das zusätzliche Fragment hätte wahrscheinlich die Größe des Inserts). Wenn dies nur aus Neugier geschieht und eines Ihrer Dinge die richtige Größe hat, würde ich diejenigen ignorieren, die nicht funktioniert haben, und mit Ihren fortfahren, die funktioniert haben.
Wenn Sie damit ein Problem haben oder alle Ihre Klone polymerisieren, können Sie Ihr Insert mit einer alkalischen Phosphatase behandeln . Dies frisst das (5')-Phosphat, das die Ligase benötigt, um das an das (3')-Hydroxyl anzuheften. Das Ergebnis ist, dass ein Insert nicht an ein anderes Insert binden kann, aber sobald es einen Vektor findet, kann es ligieren:
insert to insert: AATTagctagcatcgtgatcgacg-(3') :( CCGGcgacgatcacgatgctagct-(3')
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(3')-tcgatcgtagcactagcagcGGCC :( (3')-gctgctagtgctacgatcgaTTAA
insert to vector: ....ctagct-(3') AATTagctagcatcgtgatcgacg-(3')(5')-CCGGcgacg....
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....gatcgaTTAA-(5')(3')-tcgatcgtagcactagcagcGGCC (3')-gctgc....
Es wird oben links und unten rechts Kerben geben, aber der Fehler, in den Sie ihn eingefügt haben, sollte diese für Sie bereinigen. Sie können alkalische Phosphatase an vielen Orten ziemlich billig bekommen, NEB ist immer eine sichere Sache.
Eine zweite Untersuchung hat ergeben, dass das fragliche Ligationsprodukt tatsächlich der Vektor ohne ligiertes Insert war!
Der Vektor enthielt auch eine BamHI-Stelle in der Nähe der XmaI-Stelle, sodass ich bei einem anschließenden Verdau mit EcoRI und BamHI erwartet hatte, dieselben Bandengrößen zu sehen, die ich ursprünglich zusammenligiert hatte.
Alle Kolonien enthielten Plasmide, die die lange (Vektor-)Bande erzeugten, und die gleichen acht wie zuvor erzeugten auch die kürzere (Insert-)Bande. Jedoch fehlte den vier, die im vorherigen Experiment abweichend waren, dieses Mal das kürzere Band.
Das bedeutet, dass die acht Kolonien mit zwei Banden das gewünschte Ligationsprodukt enthielten, während die anderen vier ein Plasmid enthielten, das an einer einzigen Stelle restringiert war (unverdaut hätte es wie die Kontrolle drei Banden erzeugt).
Da die BamHI-Stelle im Vektor und während des gesamten Prozesses unberührt war, folgere ich, dass diesen vier die EcoRI-Stelle fehlte, die während der Ligation hätte regeneriert werden sollen, und daher müssen die EcoRI-Stelle und die XmaI-Stelle tatsächlich ohne ligiert worden sein irgendwie einfügen.
Um es kurz zu machen
Das bedeutet entweder
was zu einer stumpfendigen Religation des Vektors ohne Insert und folglich zum Verlust der EcoRI-Stelle führt.
Ich glaube, dass dies ziemlich wichtige Dinge sind, die beim Klonen zu berücksichtigen sind – in nachfolgenden Experimenten ließ ich mehrere Kolonien auf Negativkontrollplatten wachsen (dh Kolonien, die mit einer Kontrollligation transformiert wurden, die kein Insert enthielt), die alle wahrscheinlich auf den Verlust von Klebrigkeit zurückzuführen waren Enden und stumpfe Ligationen, was zu funktionellen Plasmiden führte, die Ampicillin-Resistenz verliehen, obwohl sie ein unerwünschtes Plasmid enthielten.