Wie ersetzt man die Intronregion in einem Plasmid?

Ich erwäge, mit dem Plasmid pRFHUE-eGFP zu arbeiten , und möchte das gpdA-Intron (das die eGFP-Promotorregion ist) durch einen Promotor aus einem anderen Organismus ersetzen.

Was wäre eine gute Strategie, um das Intron zu ersetzen, wenn ich das andere Gen bereits in der Hand habe? Würde ich das Fragment zwischen den SalI- und SmaI-Restriktionsstellen ausschneiden und dann dort den neuen Promotor mit kompatiblen Überhängen einfügen?

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Antworten (1)

Ihre Strategie würde funktionieren, aber wenn möglich, sollten Sie lieber XmaI als SmaI verwenden, da letzteres ein Blunt-End-Cutting-Enzym ist.

Außerdem würde Ihre Strategie nicht den gesamten gpdA- Promoter ersetzen , falls Sie danach streben. Vielleicht möchten Sie sich auf ihre Arbeit beziehen, wo aus Abb. 1 hervorgeht, dass die Promoterregion viel länger ist als die Region zwischen SalI und SmaI:

Abb. 1. von Crespo-Sempere et al. (2011)

Ich schätze Ihre punktgenauen Antworten zur synthetischen Biologie! Möchten Sie den Vorschlag für eine dedizierte SynBio StackExchange-Site unterstützen? area51.stackexchange.com/proposals/125068/synthetic-biology
Danke @jakebeal, aber ich bin der bescheidenen Meinung, dass Fragen der synthetischen Biologie Teil der SE-Biologie bleiben sollten. :)
Ihre Antwort hat darauf hingewiesen, dass das Plasmid auf AddGene und das in der Veröffentlichung erwähnte unterschiedlich sind. Die Richtung ist umgekehrt, sie variieren um 8 bp in der Größe und die Anmerkungen stimmen nicht überein. Ich frage mich, warum das so sein könnte.
Für das, was es wert ist, bin ich selbstlernende Synbio. Es gibt keine spezialisierten Orte im Internet, an denen ich Unterstützung erhalten kann (vielleicht DIYBio-Foren?). Ich sehe Vor- und Nachteile für eine dedizierte SE, Pro: Synbio-fokussiertes Fachwissen an einen zentralen Ort bringen, Contra: Ich scheine meine Antworten bereits von SE Bio zu erhalten.
Beachten Sie, dass das, was Sie hier als Direktionalität bezeichnen, irrelevant ist: Eine Karte wird einfach als umgekehrte Ergänzung der anderen angezeigt. Zweitens können sich die Anmerkungen unterscheiden, weil die Autoren ein bestimmtes Vokabular für das Papier gewählt haben, während die Plasmidkarte, die Sie von AddGene erhalten haben, möglicherweise automatisch auf der Grundlage der DNA-Sequenz kommentiert wird (nur raten). Und ich würde dem Größenunterschied von 8 bp nicht allzu viel Aufmerksamkeit schenken.
Wie ersetzt man die Intronregion in einem Plasmid?
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