Was sind die möglichen Gründe für zusätzliche unerkannte Banden bei der Agarose-Gelelektrophorese?

Ich führte eine 0,7%ige Agarose-Gelelektrophorese meiner Plasmid-DNA-Probe durch, die aus einem GFP-Vektor bestand, unter Verwendung von NheI- und HindIII-Restriktionsenzymen.
Ich verwendete zwei Typen von Plasmiden, dh isoliert durch das Miniprep-Alkali-Verfahren, und einen weiteren, isoliert durch das Midi-Prep-System (rein) aus der gleichen Quelle von E. coli .
Die Linien 4 und 5 zeigen geschnittenes bzw. ungeschnittenes Plasmid, isoliert durch das Midi-Prep-System.
Die Linien 1, 2 und 3 zeigen den 500-bp-Marker, geschnitten bzw. ungeschnitten des Miniprep-isolierten Plasmidsignals. Geben Sie hier die Bildbeschreibung einIm beigefügten Bild fanden wir eine zusätzliche Bande in den Plasmiden, die durch die Alkalimethode isoliert wurden (Linien 2 und 3), aber in den reinen Proben (Linien 4 und 5) wurden keine solchen zusätzlichen Banden gefunden.
Was sind die möglichen Gründe für das Ergebnis? Wie kann ich dieses Ergebnis interpretieren? Wenn jemand ähnliche Erfahrungen gemacht hat, bitte teilen.

Ich bin mir nicht sicher, was es ist, aber das ist mir heute auch auf einem Gel aufgefallen. Es war nur in Plasmiden (verdaut) vorhanden, die in DH5alpha gezüchtet wurden (und fehlte in XL1 blue). Könnte aber Zufall sein.

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Sieht für mich nach genomischer DNA-Kontamination aus.

Noch wichtiger, ist es wirklich wichtig? Ich schätze sicherlich die Neugier, aber wenn Ihr Ziel das Klonen ist, würde ich einfach weitermachen und dann nach der Transformation einige diagnostische Schnitte Ihres Plasmids machen. Sie können Ihren Vektor deutlich sehen oder in das Gel einfügen.

@SanjuktaGhosh Als als Kommentar zu antworten, ist es vielleicht besser, die Antwort direkt zu schreiben? Außerdem sieht es nicht wie ein kurzer Hinweis aus, sondern wie eine wirklich kleine Antwort, da es anscheinend nicht mehr viel zu erarbeiten oder zu zitieren gibt.
Wenn es eine gDNA-Kontamination wäre, würde ich erwarten, viel mehr Banden zu sehen ...
@JoeHealey würde ich auch, aber für mich ist es die plausibelste Erklärung für ein so großes Fragment.
Zumal es in den sogenannten „reinen“ Fraktionen fehlt, die vermutlich sauberer sind.

Könnte mehrere Dinge sein ... nur aus der Spitze von meinem Kopf. Ohne Ihre Vektorkarte und die erwarteten Größen ist es fast unmöglich, dies mit Sicherheit zu sagen.

Wahrscheinlich müssen Sie uns auch mehr Informationen über Ihre Inkubationsbedingungen usw. geben.

  1. Ihre ursprüngliche Kultur, aus der Sie sich vorbereitet haben, ist möglicherweise nicht so homogen, wie Sie denken:
    • Sie haben eine Mutante erhalten (vielleicht in Ihrer Restriktionsstelle in diesem bestimmten Klon)
    • Ihre ursprüngliche Kultur ist kontaminiert, vielleicht mit einem zweiten E. coli, das ein anderes Plasmid trägt.

Dies ist wahrscheinlich unwahrscheinlich, vorausgesetzt, Ihre molekular-/mikrobiologische Technik ist anständig, kommt aber von Zeit zu Zeit vor.

  1. Unvollständige Verdauung. Irgendetwas im Eluat Ihrer ersten Extraktionsmethode hat möglicherweise Ihre Enzyme gehemmt, das passiert bei der anderen Extraktionsmethode nicht, oder Sie haben den Aufschluss nicht lange genug stehen gelassen.

  2. Sie haben etwas aus dem Reaktionsmix für eine der Proben verpasst (normalerweise mache ich mir zuerst die Schuld, wenn etwas schief geht, also wiederhole ich es normalerweise einfach, um sicherzugehen!)

Wie führt ein unvollständiger Verdau zu einer Molekülgröße, die viel größer ist als das gesamte Plasmid (Spur 4 und 5)?
Ungeschnittenes Plasmid kann in allen möglichen Längen laufen. Wenn es supergewickelt ist, läuft es weiter, als es für seine Größe "sollte". Wenn es kreisförmig, aber nicht supergewickelt ist, läuft es langsamer als es "sollte", als wenn es ein einzelnes lineares Fragment wäre, da es sich nicht leicht durch das Gel bewegt.
Was sind die möglichen Gründe für zusätzliche unerkannte Banden bei der Agarose-Gelelektrophorese?
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