Wie viele Agarosegelbanden sind typisch für zirkularisierte DNA?

Ich habe es nicht in der Hand, aber es würde mich nicht überraschen, wenn superspiralisierte DNA gemäß einer inneren topologischen Konformation (dh mehr oder weniger gewickelt UND/ODER mehr oder weniger geknickt) in unterschiedlichen Entfernungen wandert. In ähnlicher Weise hebt dieses Bild >8 Konformationen hervor. Was in das Gel läuft, ist zirkularisierte Phagen-DNA mit einem gewissen Grad an Verknotung aufgrund der Zirkularisierung (Phagen-DNA ist ansonsten linear).

Abbildung aus: Arsuaga et al. 2005, PNAS 102 (26) 9165-9169 ( kostenlos auf PubMed Central )

Eine andere theoretische Möglichkeit besteht darin, dass zwei oder mehr Plasmide unterschiedlicher Größe aufgrund einer gewissen Kontamination in demselben Maxiprep gezüchtet wurden. Aber in diesem Fall werden Sie das Problem auch in der Verdauung erkennen, also scheint es nicht Ihr Fall zu sein.

Gianpaolo hat Recht, dass Sie die verschiedenen Konformationen der zirkulären DNA sehen.

Die Züchtung von Plasmiden in Bakterien produziert 3 Hauptformen: Relaxed, Coiled und Super-Coiled.

• Relaxed neigt dazu, etwas höher als die erwartete Größe zu laufen, da es nicht so effizient durch die Agarase wandern kann;
• Coiled wandert etwas weiter als die erwartete Größe, weil es etwas kompakter ist und daher leichter wandert;
• Super-Coiled, das kompakteste, wandert viel weiter als die erwartete Größe.

Ich würde aus deinem Bild folgendes schließen:

1. Dass die HindIII-Schnitte effizient sind und fast Ihr gesamtes Plasmid linearisiert haben.
2. BamHI schneidet, aber nicht so effizient wie HindIII für (vermutlich) die gleiche Zeitdauer. Dies sollte länger verdaut werden, wenn es wirklich wichtig ist, nur mit BamHI zu verdauen, aber für diagnostische Zwecke ist es in Ordnung. Ich sage das wegen der schwachen Bandenbildung bei ~4,5 und ~3,7 kb, die wahrscheinlich Ihre gewundene bzw. supergewundene Plasmid-DNA sind.
3. Aus Ihren linearen Verdaus ist das Plasmid 6 kb groß.
4. Wenn Sie sich das unverdaute Kontrollplasmid ansehen, ist Ihre Mini-Prep-Methode nicht sauber und scheint kontaminiert zu sein, möglicherweise durch genomische DNA. Außerdem sehen Sie Hinweise auf Schlierenbildung in den einzelnen Digest-Lanes. Wurde das mit Trizol gemacht?
5. Ich würde erwarten, dass die Bande bei 10 kb möglicherweise die entspannte Form des Plasmids ist, wobei ein Großteil der Plasmid-DNA in einer Super-Coiled-Konformation vorliegt.

Wenn es sich um wichtige Proben handelt, würde ich erwägen, sie mit saubereren Methoden zu reinigen, beispielsweise mit einer Säule.

Ich denke, diese Antworten haben alle die wahrscheinlichste Erklärung für die mehreren Banden in der ungeschnittenen Probe verpasst. Ich stimme zu, dass Sie wahrscheinlich supergewickelte, lineare und entspannte (offene) Kreise in dieser Reihenfolge sehen werden, die das Gel hinaufgehen. Aber dann sind all diese höheren Formen dasselbe, was für Dimere, Trimere usw. wiederholt wird, die durch Rekombination zwischen Plasmidmolekülen gebildet werden. So denke ich zum Beispiel, dass die 10-kb-Bande in den ungeschnittenen Bahnen ein Supercoiled-Dimer ist. Ich habe eine schwache Erinnerung daran, dass man mehr davon sieht, wenn die DNA aus einem recA- Stamm von E. coli präpariert wurde .

update Hier ist jemand, der meiner Meinung nach zustimmen würde.