Plasmid im Zellkern und Genexpression

Wenn wir ein Plasmid in einen menschlichen Kern einfügen , das eine exakte Kopie des Gens und alle relevanten Promotoren enthält, um ein menschliches Protein zu produzieren , wird die Zelle dann aus diesem Plasmid nur dann ein funktionelles Protein erzeugen, wenn die Zelle es benötigt?

Ich spreche nicht über das Einfügen von DNA in irgendein Chromosom. Einfügen eines separaten Plasmids in den Zellkern (transiente Transfektion).

Antworten (1)

Wenn Sie Zellen mit Plasmid transfizieren, müssen diese Plasmide in den Zellkern gelangen (sonst würden sie nicht transkribiert). Die Gewinnung des Plasmids geschieht entweder während der Zellteilung (wenn der Zellkern nicht vorhanden ist) oder durch Hinzufügen einer Signalsequenz zum Plasmid, die den Import in den Zellkern durch Kernporen induziert. Die SV40-Sequenz ist ein Beispiel für eine solche Sequenz.

Wenn Sie den richtigen Promotor auf dem Plasmid haben, können Sie grundsätzlich jedes Protein in der Zelle exprimieren (es sei denn, es ist toxisch). Der Promotor muss entweder aus dem Organismus stammen, aus dem die Zellen stammen, oder er muss etwas Universell Aktiviertes sein, wie der CMV-Promotor (aus dem Cytomegalie-Virus).

Ein gutes Beispiel dafür ist die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP), das aus Quallen stammt und in Zellen exprimiert werden kann, um sie grün leuchten zu lassen (von hier ):

Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Untransfizierte Zellen oder mit einem leeren Plasmid (ohne GFP) transfizierte Zellen leuchten nicht.

Das Targeting bestimmter Zellen oder die Steuerung der spezifischen Aktivierung von Genen nur in einem Zelltyp ist möglich. Für beide benötigen Sie sequenzielle (und zellspezifische) Promotorsequenzen, die entweder den Kernimport (siehe Referenz 1-3) oder die Expression von einem zelltypspezifischen Promotor (siehe Referenz 4) erlauben.

Dies wurde in der Leber von Mäusen durchgeführt, in denen das ApoE ausgeschaltet wurde. Die Expression des humanen ApoE-Gens mit einem spezifischen Promotor führte zur Korrektur der Hypercholesterinämie, an der die Mäuse litten. Dies erfordert viel Wissen über den Promotor sowie über die anderen Transkriptionsregulationselemente in dem spezifischen Gen (siehe Referenz 4).

Verweise:

  1. Zellspezifischer Kernimport von Plasmid-DNA.
  2. Gewebespezifischer und Transkriptionsfaktor-vermittelter Kerneintritt von DNA.
  3. Fortschritte und Perspektiven: nuklearer Import nichtviraler Vektoren.
  4. Anhaltende leberspezifische Transgenexpression vom Albumin-Promotor in Mäusen nach hydrodynamischer Plasmid-DNA-Lieferung.
Danke, Chris. Ich habe die Frage bearbeitet, es ist vielleicht nicht klar, ich meine ein menschliches Protein, das in normalen menschlichen Zellen vorkommt. Nehmen wir an, die DNA, die für dieses Protein kodiert, ist beschädigt, und jetzt fügen wir ein funktionierendes Plasmid ein. Wird die Zelle also auch jetzt funktionierendes Protein herstellen, und zwar nur dann, wenn die Zelle es braucht? Danke nochmal.
Das ist schwieriger, ich werde die Antwort bearbeiten.
@chris GFP kommt von Wachtel? Ich dachte, es käme von einer Qualle. Und der Eintritt in den Zellkern ist nicht einfach, Plasmide dringen nicht einfach in den Zellkern ein. In sich schnell teilende Zellen können sie eindringen, wenn der Zellkern während der Mitose zusammenbricht. Sie dazu zu bringen, sich durch den Kernporenkomplex zu bewegen, ist schwieriger.
@ user137 Du hast Recht, ich habe das falsche Wort verwendet. Auch über das Betreten des Kerns. Ich habe den Beitrag editiert, danke für die Korrektur.
@Chris Die SV40-Sequenz ist interessant. David Dean hat viel über zytoplasmatische Transkriptionsfaktoren gearbeitet, die an Plasmid binden und es in den Zellkern ziehen. Mein Chef glaubt es nicht, ich bin unentschlossen. Ziemlich viele Artikel darüber, aber ich habe selbst keine Experimente versucht. Ich vermute, dass das verwendete Transfektionsmittel seine Funktionsweise verändern kann, denn wenn Ihr PEI oder Lipofectamin oder was auch immer nicht dissoziiert, können die Transkriptionsfaktoren ihre Bindungsstellen möglicherweise nicht erreichen.
@ user137 Interessanter Gedanke. Es wäre dann auch möglich, dass das Transfektionsreagenz dabei hilft, die Kernmembran zu passieren.
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