Ich versuche gerade zu sehen, ob 2 Bakterien Plasmide enthalten oder nicht. Ich hatte das Promega-Plasmid-Extraktionskit für die Bakterien verwendet. Ich habe eine Gelelektrophorese (0,8 % Gel) mit dem Extraktprodukt durchgeführt, es zeigt jedoch keine DNA. Ich habe das Produkt auch durch Nanodrop (2000) laufen lassen und hier die Konzentrationen, die ich erhalten habe:
1: 6,5 ng/ul & 260/280 = 1,56
2: 49,4 ng/ul & 260/280: 1,96
Aufgrund meiner Erfahrung möchte ich sagen, dass Nr. 1 keine Plasmide enthält, Nr. 2 jedoch möglicherweise eine geringe Konzentration von Plasmiden enthält. Bitte geben Sie mir Ihre Meinung darüber, was ich abschließend sagen soll. Wenn es einen anderen Test gibt, den ich versuchen kann, um zu bestätigen, dass Plasmid vorhanden ist oder nicht, lassen Sie es mich bitte wissen.
Ich weiß nicht, wie viel Kulturvolumen Sie verwendet haben, aber die Mengen, die Sie haben, sehen eher wie ein Plasmid mit mittlerer / hoher Kopienzahl aus. Ich weiß nicht, ob man das von einem natürlichen Plasmid erwarten würde.
Zusätzlich zu der anderen Antwort könnte es sich auch um gescherte genomische DNA, Cosmid (das auf Ihrem Gel zu hoch laufen würde, um es zu sehen) oder vielleicht nur um Nukleotide handeln (wenn Sie die Vorbereitung auf irgendeine Weise durcheinander gebracht haben).
Eine andere Strategie, um herauszufinden, ob Ihr Stamm Plasmide enthält, hängt davon ab, was Sie sonst noch über diese Stämme wissen. Wenn Sie nicht so viel wissen: Führen Sie eine 16S-Sequenzierung durch, es könnte sich um einen bekannten Stamm mit bekannten Plasmiden handeln. Wenn Sie bereits wissen, dass es sich um eine neu entdeckte Sorte handelt: Sequenzieren Sie das Ganze. Selbst bei relativ geringer Bedeckung ist das Vorhandensein von Plasmiden ziemlich deutlich. Es ist etwas teurer als ein Plasmidpräparat + Gel, aber Sie erhalten auch viele andere Informationen über den Organismus.
Ein positiver Messwert auf dem Nanodrop, aber keine Bande auf dem Gel, kann auf eine Reihe verschiedener Probleme zurückzuführen sein (nicht erschöpfend):
Sie sollten versuchen, diese Möglichkeiten durch Positivkontrollen auszuschließen, um den wahren Grund für die widersprüchlichen Ergebnisse herauszufinden.
Ich würde empfehlen, Ihr PCR-Klonprogramm umzustellen. Selbst nach Aufreinigung von DNA und RNA in Verbindung mit großer Sorgfalt kann die PCR oft der Flaschenhals für die Gelelektrophorese sein, ebenso wie die Gewährleistung der Qualität (Tiefe, keine stumpfen Kanten usw.) des Agarosegels - 49 ng/ul ist es nicht genug für den Fortschritt. Wenn all das Ihren Fall immer noch nicht verbessert, dann könnte es ein Problem mit der Kultivierung von Bakterienkulturen sein - nach der Reinigung von Plasmiden aus Bakterienklonen sollten die Fläschchen sehr trüb erscheinen (8-16 Stunden war mein Zielzeitraum). Vermeiden Sie es außerdem Lichteinwirkung auf das Agarosegel sowie das Sauberhalten und Eintauchen in kaltes PBS, bevor Sie Ihre gepufferte DNA einfügen (ich habe 10 Mikroliter verwendet - aber es variiert tendenziell je nach Dicke Ihres Gels).
Wenn nichts funktioniert... dann kann ich nur auf mögliche menschliche Fehler anspielen. Letztes Ding! Ich hoffe, Sie reinigen den Nanotropfen, bevor Sie zählen, Protein in Ihrem Produkt kann eine Folge davon sein. viel Glück! Bakterien brauchen auch Liebe!
Je nachdem, wie Sie das Protokoll befolgt haben, könnten Sie theoretisch auch bakterielle genomische DNA in Ihrer Probe haben. Wenn Sie sich strikt an das Protokoll halten, sollte dies nicht passieren, aber wenn ja, könnten Sie die genomische DNA messen. Im Agarosegel würde es jedoch normalerweise oben herum kleben, da es zu groß ist, um zu wandern.
Dies kann beispielsweise durch Vortexen der Probe vor dem Beladen der Säule verursacht werden (siehe Promega PureYield Manual).
Chris
Benutzer137
A. Radek Martínez