Wie werden die Fehlerraten der DNA-Polymerase gemessen?

Es ist allgemein bekannt, dass die erste DNA-Polymerase, Taq , ziemlich fehleranfällig ist. Kommerzielle Enzyme der neueren Generation, die entweder aus verschiedenen thermophilen Spezies isoliert oder durch Rekombination verbessert wurden, sind weniger fehleranfällig. Wie werden diese Fehlerquoten verglichen? Wenn dies beispielsweise durch Sanger-Sequenzierung erfolgt, dominiert das durchschnittliche Signal beim Lesen der Ausgabe, und daher ist es sehr unwahrscheinlich, dass durch dieses Verfahren Fehler erkannt werden.

Die Taq-Produkte konnten vor der Sequenzierung kloniert werden. Es ist jedoch immer noch kompliziert, da derselbe Fehler in zwei Produkten denselben Fehler darstellen könnte, der zweimal de novo auftritt, oder die Ausbreitung eines einzelnen Fehlers, der in einer frühen Amplifikationsrunde aufgetreten ist.
Aus diesem Grund war ich skeptisch gegenüber einem sequenzierungsbasierten Ansatz. Ich nehme an, die unten von Alan Boyd beschriebene Methode ist ein funktionaler Ansatz, aber dieser maskiert immer noch synonyme Mutationen und stellt daher die wahre Fehlerrate unterrepräsentiert.

Antworten (1)

Laut ihrer Website verwenden New England Biolabs eine Version des von Wayne Barnes entwickelten Ansatzes, wie beschrieben in:

Kermekchiev, MB, Tzekov, A. und Barnes, WM (2003) Nucl. Säuren Res. 31, 6139–6147

Dies ist im Grunde ein Assay für die Mutationsrate in einem PCR-amplifizierten lacZ (β-Galactosidase)-Gen, getestet durch Transformieren von E. coli , Ausplattieren auf dem chromogenen β-Galactosidase-Substrat Xgal und dann Bewerten weißer Kolonien als mutierte Gene. Ebenfalls laut NEB verwendet Agilent Technologies einen ähnlichen Mutationsassay, der jedoch auf dem lacI -Gen (lac-Repressor) basiert.

Vielen Dank für den Hinweis. Dies scheint der pragmatischste Ansatz für dieses Problem zu sein. Obwohl diese Methode die Fehlerrate konstruktionsbedingt zu niedrig angibt, wäre dies eine konsistente Verzerrung über Polymerasen hinweg.
Es ist möglich, dass sie den Mutationstest irgendwo entlang der Linie auf einen strengeren Ansatz kalibriert haben, aber ich vermute nur. Wie Sie sagen, ist für sie die relative Treue wichtiger als der absolute Wert.
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