Langstrecken-PCR mit NEB Master Mix - Hot Start Taq funktionierte gut für mich (Amplikongrößen von ~ 10 kb), funktionierte aber plötzlich nicht mehr. Ist es möglich, dass viele Gefrier-Tau-Zyklen auf der DNA-Matrize Kerben in den DNA-Strang einführen, die die Polymerase-Aktivität behindern? In bestimmten Fällen erhalte ich keine Verstärkung und in einigen erhalte ich eine sehr schwache Verstärkung. Da die Integrität der DNA im Falle einer Langstrecken-PCR über die gesamte Länge intakt sein sollte, gehe ich richtig in der Annahme, dass Kerben in der DNA besonders schädlich sind, wenn wir versuchen, große Fragmente zu amplifizieren?
Die Konzentration der von mir verwendeten DNA-Matrizen betrug 90-140 ng/ul in einer 10-ul-PCR-Reaktion, DNA, die in TE-Puffer nach einem Magnetkügelchen-Verfahren der DNA-Extraktion eluiert wurde.
Es ist nicht unwahrscheinlich, dass Nicking Probleme verursacht. Die Frage ist, ob wiederholtes Einfrieren und Auftauen das Problem verursacht. Es gibt einen Artikel, der 1983 im BRL Focus veröffentlicht wurde und diesen Effekt bestreitet. Das PDF mit dem Artikel finden Sie hier , der Artikel selbst beginnt auf Seite 10 im PDF. Andererseits gibt es diesen Artikel (" Impact of long-term storage on Stability of Standard DNA for Nucleinsäure-based Methods. "), der zeigt, dass die Lagerbedingungen einen Einfluss auf die Effizienz von qPCR-Standards haben. Was auch immer Nicking verursacht, es ist ein Problem bei (langer) PCR. Das folgende Zitat stammt von Sigma in ihrem langen PCR-Enzymmix:
Template Eine hohe Qualität und ausreichende Länge des Templates sind für eine zuverlässige Amplifikation größerer Fragmente unerlässlich. Bei der Vorbereitung und Handhabung des DNA-Targets für lange PCR ist äußerste Sorgfalt geboten. Angeschnittene oder beschädigte DNA kann als potenzielle Priming-Site dienen, was zu einem hohen Hintergrund führt. Einfrieren vermeiden oder alternativ nur einmal einfrieren, um Schäden zu minimieren. Der Zustand der Ziel-DNA ist kritisch. Die Depuration während des Zyklus wird durch die Verwendung von Puffern mit einem pH-Wert von mehr als 9,0 bei 25 °C minimiert.
Diese Abhandlung („ Effect of Highly Fragmented DNA on PCR “) zeigt, dass induzierte Nicks die Effizienz der PCR beeinflussen (obwohl sie eine viel kürzere Amplifikation durchführen als Sie). Um dieses Problem zu lösen, würde ich also kleine Aliquots frischer DNA-Präparationen herstellen und dann sehen, ob dies hilft.