Amplifiziert gängige PCR Gene unabhängig davon, in welchen Zellen/Barrieren sie sich befinden?

Ich habe ein gewisses Verständnis dafür, wie PCR-Tests funktionieren. Was ich mich schon immer gefragt habe: Wie können wir sicher sein, dass ein Primer mit dem/den Zielgen(en) reagiert, unabhängig davon, wo¹ sich die Gene in einer Probe befinden?

¹: Speziell mit "wo" meine ich, in welchen Zellen oder anderen Barrieren sie sich befinden. Mit anderen Worten lautet meine Frage: Wie können wir sicher sein, dass Primer jedes mögliche Ziel erreichen?

Genauer gesagt: Wenn wir auf ein Gen abzielen, das Teil des eigenen Genoms des Wirtsorganismus ist, können die Dinge ziemlich klar sein, wir können starke Annahmen darüber haben, „wo“ sich das Gen befindet. Aber wenn man auf Gene abzielt, die Teil von Organismen sind, die eine parasitäre Beziehung zum Wirt haben, sollte ein sehr komplexes System von Interaktionen (meistens als "Immunsystem" bezeichnet) die (Ko-)Existenz von Wirt und Parasit regeln. Diese komplexen Wechselwirkungen können zu Situationen führen, in denen der Parasit an einem ganz besonderen, isolierten Ort im Wirt präsent ist. Ein Beispiel: Mikroorganismen in den Zellwänden von Makrophagen, die kurz vor der Lyse stehen. Können wir sicher sein, dass gängige PCR Gene solcher Mikroorganismen nachweisen würde? Warum?

BEARBEITEN: Wie in den Kommentaren erwähnt, ist die vielleicht richtigste Formulierung, wie garantieren die verwendeten DNA-Isolierungstechniken, dass Primer jedes mögliche Ziel erreichen?

PCR wird nicht in lebenden Organismen durchgeführt. Die DNA muss zuerst isoliert werden.
Das ist richtig und war mir beim Posten der Frage klar. Meine Frage, die auf Ihrem Kommentar basiert, könnte also auch formuliert werden: Wie garantieren DNA-Isolierungstechniken, dass die DNA aller möglichen Ziele aus einer Probe isoliert wird? Ich werde meine Frage mit Ihrer genaueren Formulierung aktualisieren, danke!
Sie werden nur die DNA nachweisen, für die Sie spezifische Primer einsetzen. Sie könnten zufällige Primer verwenden, aber dann wird es Ihnen schwer fallen, zu quantifizieren, was Sie verstärken. Wenn Sie eine Transkriptomanalyse in Eukaryoten durchführen, können Sie einen Poly-T-Primer und Reverse Transkriptase verwenden, um mRNA in cDNA umzuwandeln. Von dort aus müssten Sie eine Art Microarray ausführen, um zu erkennen, was Sie herunterziehen. Also, nein, es sei denn, Sie setzen Primer für die Spezifität für den Mikroorganismus ein, den Sie haben, Sie sollten keine Amplifikation erhalten, es sei denn, Sie verwenden zufällige Primer.
@canadianer Das ist falsch. Kolonie-PCR kann die Amplifikation bakterieller DNA ermöglichen, selbst wenn die Bakterien dem PCR-Gemisch zugesetzt werden, während sie noch leben und lebensfähig sind, und dasselbe gilt für Säugetierzellkulturen.
@MarchHo Nirgendwo in dieser Beschreibung sehe ich PCR, die in lebenden Organismen durchgeführt wird.
@MarchHo canadianer hat grundsätzlich Recht: Das von Ihnen verlinkte KIT verwendet die Denaturierung von Proteinen bei meist 95 ° C, wie in der Anleitung beschrieben. Somit wird jeder Organismus, dessen DNA isoliert wird, aufgelöst. Sie haben Recht, die Mikroorganismen und Säugetierzellen leben, wenn sie hinzugefügt werden, aber sie werden während des Prozesses genau so zerlegt, wie es der Kanadier erklärt hat.
Obwohl Ihr Verständnis richtig ist, stimme ich der Formulierung von @canadianer immer noch nicht zu. Die DNA wird aus den Zellen freigesetzt, aber zu keinem Zeitpunkt wurde die DNA jemals vor Abschluss der PCR-Reaktion gereinigt oder isoliert.

Antworten (3)

Es gibt viele Methoden zur DNA-Isolierung, daher ist es schwierig, allgemeine Aussagen zu allen Situationen zu treffen. Typischerweise werden jedoch während des DNA-Isolierungsprotokolls im Wesentlichen alle Proteine ​​denaturiert und entfernt, ebenso wie RNA, Zellmembrankomponenten, extrazelluläre Matrix usw. Wenn Sie ein hochwertiges, gut validiertes Kit von einem seriösen Anbieter verwenden, ist Ihr endgültiges Produkt sollte nur DNA sein. In Ihrem hypothetischen Szenario, in dem Parasiten von Makrophagen verschlungen wurden (Übrigens, Eukaryoten haben keine Zellwände), wird sie nach dem Reinigungsprozess auf einer bestimmten Ebene vorhanden sein, solange die parasitäre DNA nicht abgebaut wurde. Solange sie über der minimalen Sensitivität der PCR-Reaktion liegt, werden alle anvisierten parasitären Gene amplifiziert.

Während des PCR-Prozesses denaturiert und schmilzt der Erwärmungsschritt auf 95 °C die gesamte vorhandene DNA vollständig, wodurch die Primer uneingeschränkten Zugang zu ihren komplementären Sequenzen erhalten, wo sie dann während des Annealing- und Verlängerungsschritts Basenpaare bilden können.

Danke für die Antwort! Können Sie genauer erklären, wie die DNA eines Mikroorganismus, der in die Zellmembran eines Makrophagen eingeschlossen ist, den Isolierungsprozess übersteht? Warum verwirft die Hochgeschwindigkeitszentrifugation den Makrophagen nicht vollständig? Kann Denaturierung (oder ein anderer Prozess), wie er bei Isolationstechniken eingesetzt wird, die Lipidmembran eines Makrophagen und die Zellwand des verschlungenen Mikroorganismus zersetzen?
@BM Es gibt verschiedene Kits für verschiedene Arten von Proben. Wenn Sie also Proben mit Zellwänden verarbeiten, stellen Sie sicher, dass Sie die richtigen Reagenzien auswählen. Der Lyseprozess ist ziemlich hart und denaturiert so ziemlich alles. Sehen Sie sich einige der Informationen bei Qiagen an , einem der angesehensten Unternehmen auf diesem Gebiet. Die Zentrifugationsschritte erfolgen nach der Lyse (die andere Antwort ist in dieser Hinsicht ziemlich verwirrend), sodass Sie keine Zellen verlieren.
@BM Hier ist eine Auswahlhilfe für die Art des Kits zur Reinigung genomischer DNA.
Danke für den Link und deinen Kommentar. Ich sehe, dass das ganze Problem komplexer ist als ich dachte und darauf hinausläuft, welches Isolations-KIT Sie verwenden. Ich möchte jedoch noch viel genauer wissen, wie diese funktionieren, also werde ich Ihre Antwort akzeptieren und eine neue Frage mit mehr Details eröffnen.
@BM danke. Wenn Sie sich auf der Website von Qiagen umsehen und zu den Produktseiten für die verschiedenen Kits gehen, sollten Sie in der Lage sein, Dokumentationen darüber zu finden, wie sie funktionieren und was die verschiedenen Puffer tun.
Das werde ich, und vielleicht frage ich Qiagen sogar direkt. Vorerst meine Folgefrage, falls Sie interessiert sind: biology.stackexchange.com/questions/40198/…

Die Polymerase-Kettenreaktion wird an freier DNA durchgeführt, die durch eine Vielzahl chemischer oder physikalischer Methoden aus der Zelle freigesetzt wurde.

An der PCR sind keine Zellen beteiligt, da die unerwünschten Komponenten durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation abgetrennt werden.

Die PCR erfordert auch Wärmezyklen, um das Abwickeln von DNA für die Bindung von Primern zu unterstützen, was auch die Funktionalität von TAQ-Polymerase ermöglicht, die eine aus dem Bakterium Thermus aquaticus isolierte DNA-Polymerase mit hoher Wärmeentwicklung ist .

Sofern Sie also nicht von einer anderen Reaktion sprechen, sind an der PCR keine lebenden Organismen, einschließlich Zellen, beteiligt. Sie werden entfernt.

Danke für deinen Beitrag! Ich habe meine Frage vielleicht nicht genau genug formuliert. Meine in der Bearbeitung erwähnte Frage kann auch so formuliert werden: "Können wir sicher sein, dass die Isolierungstechniken mögliche Ziele, z. B. von Makrophagen, nicht verwerfen?" Wenn Sie Ihren Posten annehmen, scheint die Antwort zu lauten: "Wir können sicher sein, dass Isolationstechniken die meisten relevanten Ziele verwerfen werden ." Können Sie das näher erläutern?

Ich denke, die richtige Antwort ist "sie tun es nicht". Wenn Sie eine PCR an einer Probe durchführen, über die Sie nicht viel wissen, würden Sie sicherlich eine Positivkontrolle einschließen, dh einen Primer, der etwas amplifizieren sollte, von dem Sie glauben, dass es definitiv in Ihrer Probe vorhanden ist. Wenn Sie eine Bande für die Positivkontrolle erhalten, wissen Sie, dass Sie die Zellen erfolgreich lysieren konnten und nichts anderes Ihre PCR störte.

Die meisten modernen Techniken bei typischen Proben sind ziemlich gut, daher ist dies selten ein Problem. Aber im Allgemeinen würden Sie es vorziehen, Ihr Experiment so zu gestalten, dass es sich auf positive Ergebnisse von PCR verlässt, anstatt auf negative.

Amplifiziert gängige PCR Gene unabhängig davon, in welchen Zellen/Barrieren sie sich befinden?
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