Wirkung der Deletion oder Insertion einzelner Nukleotide auf das Primer-Annealing

Wie wird das Primer-Annealing und folglich die PCR-Amplifikation durch die Deletion oder Insertion einzelner Nukleotide in den Primer beeinflusst?

Stellen Sie sich einen Primer wie diesen vor:
GCGTCATAAAGGGGACGTG (Primer)
und dem entsprechenden Teil der Template-DNA fehlt ein G, also sieht es so aus:
GCGTCATAAAGGGACGTG (Template).


Die mögliche Paarung könnte GCGTCATAAAGGGGACGTG-Primer
GCGTCATAAA_GGGACGTG-Matrize
oder
GCGTCATAAAGGGGACGTG-Primer
GCGTCATAAAGGG_ACGTG-Matrize
oder irgendetwas dazwischen sein .

Ist es möglich, dass die Amplifikation mit einem solchen Primer bei normaler Echtzeit-PCR bei 60 °C Annealing vollständig gestört wird? Könnte dies die Verstärkung vollständig stören?

Wenn die Fehlpaarung substitutionsartig wäre , wäre ich ziemlich zuversichtlich, dass der Primer noch funktionsfähig wäre und eine Amplifikation stattfinden würde. Im Extremfall wäre es zumindest eine Restverstärkung am späten Ct. Es gibt viele Daten darüber, wie sich Substitutionsfehlpaarungen auf Primer auswirken, und ich habe auch viele persönliche Erfahrungen damit.

Leider sind die Löschkonflikte weniger untersucht und googleproof. Der einzige Hinweis, den ich gefunden habe, ist diese Arbeit:
Lipsky RH, Mazzanti CM, Rudolph JG, Xu K, Vyas G, Bozak D, et al. DNA-Schmelzanalyse zum Nachweis von Einzelnukleotid-Polymorphismen. Klinik Chem. 2001;47:635-44.
In dieser Arbeit hatte die Deletion einzelner Nukleotide einen ähnlichen oder geringeren Einfluss auf die Schmelztemperatur als die Substitutionsfehlpaarung. Aber es ging um längere Oligos. Beispiele:
Auswirkung der Deletion:
133 bp Fragment, 67 % GC, Deletion SNP an Position 43, delta Tm (Homo-Hetero-Duplex) = 1,2 °C
Auswirkungen der Substitutionen:
152 bp Fragment, 43 % GC, Substitution T zu C an Position 68, Delta Tm (Homo-Hetero-Duplex) = 0,9°C
100 bp Fragment, 41 % GC, Substitution T zu C an Position 42, delta Tm (homo-hetero duplex) = 1,4°C
163 bp Fragment, 60 % GC, Substitution C zu T an Position 86, delta Tm (homo-hetero Duplex) = 2,2°C
110 bp Fragment, 59 % GC, Substitution G zu A an Position 66, delta Tm (Homo-Hetero-Duplex) = 3,8°C

Fragen :
1. Können Sie mir Literatur darüber empfehlen, wie Deletionsfehlpaarungen innerhalb (nicht ganz am Ende!!!) von Primern Annealing und PCR beeinflussen?
2. Würden Sie vermuten, dass der Primer in meinem Beispiel noch funktionsfähig ist, zumindest teilweise, oder würden Sie überhaupt keine Amplifikation erwarten?

BEARBEITEN nach Ihren Eingaben:
Diese Online-Anwendung "mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Two-state-melting" denkt, Löschfehlanpassungen sind destabilisierender als Substitutionen, zumindest für kurze Primer. Für mein eigenes Beispiel wurde Delta Tm (Homo-Hetero-Duplex) = 12,9 ° C berechnet. Wenn ich stattdessen Substitutionsfehlpaarungen versuche, liegt Delta Tm (Homo-Hetero-Duplex) im Intervall von 3,8 ° C bis 5,7 ° C.

Neue Frage
Wenn Sie möglichst ähnliche Erfahrungen wie in meinem Fall haben, bei dem es sich um einen 19 nt langen Primer mit Einzelnukleotiddeletion in der komplementären Matrize an Position ca. 6 - 9 vom 3'-Primerende handelt, bei einer Annealing-Temperatur von 60 ° C, lassen Sie es bitte Ich weiß, ob Sie eine Verstärkung erreicht haben oder nicht. Bitte geben Sie mir eine entsprechende Referenz, wenn Sie eine haben, damit ich sie in meiner Rezension zitiere :-) .

Außerdem bin ich immer noch an allgemeinen Informationen interessiert, solange das Thema eng genug ist, um sich mit einzelnen Nukleotiddeletionen oder -insertionen in Primern zu befassen. (Keine Substitutionsinkongruenzen).

Primer wären funktionsfähig, solange die 3'-Enden richtig zusammenpassen und die Fehlpaarung nicht groß ist. Sie können die geänderte Schmelztemperatur mit dem UNAfold DNA-DNA-Hybridisierungsserver berechnen.
Sehr schöne Bewerbung, danke! Für andere - ich habe herausgefunden, wo genau man die Sequenzen auf dem Server eingibt: mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Two-state-melting
Ähnlich wie bei @Chris habe ich längere, sogar Ultramers verwendet, um Löschungen zu verursachen. Ich war neugierig, wie klein ich die Primer machen könnte, aber ich hatte immer den Luxus, sie ohne besorgniserregende 2ndary-Strukturen ziemlich lang machen zu können. Haben Sie darüber nachgedacht, dies an einer Testvorlage auszuprobieren, um zu sehen, wie es läuft? Wäre nicht zu kostspielig zu testen (ich habe es in Betracht gezogen).

Antworten (2)

Wir haben diese Art von Primern verwendet, um Out-of-Frame-Mutationen zu erzeugen oder um zusätzliche Basen hinzuzufügen. Meiner Erfahrung nach funktioniert Ihre PCR (wahrscheinlich mit geringerer Effizienz) und Sie erhalten ein Produkt mit einer zusätzlichen Base. Wir haben Primer mit größeren Unterschieden in der PCR-basierten ortsgerichteten Mutagenese von Plasmiden verwendet, da stimmten bis zu 10 Basen nicht überein, aber die Primer waren auch länger. Für einzelne Nukleotidfehlpaarungen (entweder + oder – eine Base) verwendeten wir Primer um diese Größe herum.

In Bezug auf die Literatur könnten diese Veröffentlichungen nützlich sein:

Besonders die Erstveröffentlichung enthält viele weitere interessante Referenzen.

Wenn Sie sich keine Sorgen um Ihre Identität machen, könnten Sie mir eine Referenz für Ihre Veröffentlichung schicken, wo es einen Primer dieser Größe (ca. 19 nt) gab, eine einzelne Nukleotid-Deletion oder -Insertion aufwies und immer noch funktionierte? (Ich weiß, dass ich wahrscheinlich zu anspruchsvoll bin, weil Sie mir bereits 4 Veröffentlichungen geschickt haben. Es wäre nur praktisch, gleich eine Referenz für dieses spezifische Beispiel zu haben).
Keine große Sache: Schauen Sie sich dieses Papier an , die Sequenzen sind in den Zusatzdaten. Die kürzesten Primerpaare sind 25mere. Die Länge wird durch die umgebende Sequenz bestimmt.
@Barbara Was ich vergessen habe: Ich habe kürzlich etwas kürzere Primer (21- und 22mers) verwendet, aber diese Ergebnisse wurden noch nicht veröffentlicht.
@Chris: Danke, zumindest habe ich die Gewissheit, dass es so funktionieren kann. Aber wenn Sie sich zufällig daran erinnern, dass Sie eine Posterpräsentation haben, in der diese kurzen Einführungen erwähnt werden, lassen Sie es mich bitte wissen.
@ Chris nochmal: Die Artikel, die Sie aufgelistet haben, sagen nichts über einzelne Nukleotidlöschungen aus, mit Ausnahme von Kwok 2014, das Minimum sagt. (Kwok sagt, dass die Primer verwendet werden können, um Indel-SNP einzuführen, und dass sie in der Mitte von Oligos mit 24 bis 36 Basen platziert werden sollten.) Ihr eigener Artikel erwähnt nur lange (46 nt) Oligos, die 3 nt Indel überspannen. Übersehe ich etwas?
Ja, das tust du. Im ergänzenden Dokument sind 25mere dokumentiert.
@ Chris Die einzigen 25 nt langen Primer sind N278D-F und N278D-R. Der Vergleich mit der nrnt-Datenbank zeigt, dass N278D-F ein zentrales G hat, wo die meisten Mäuse ein A haben. N278D-R hat ein zentrales C, wo die meisten Mäuse ein T haben. Es sieht nach Substitutionsfehlpaarungen aus, nicht nach Indels. (Die Begrenzung der Explosion auf Homo sapiens ergibt keine guten Primerübereinstimmungen). In welcher Grundierung befindet sich ein Indel-Mismatch und gegen welche Vorlage sollte ich es sprengen, um das Indel selbst zu sehen?
Ich habe nie über Indels gesprochen, für diesen Zweck benötigen Sie längere Oligos. Dieser kurze Primer wurde verwendet, um eine Punktmutation einzuführen. Was nach unseren Sequenzierungsergebnissen ganz gut funktioniert hat.
@ Chris Woher kommt die Information, dass (einzelne Nukleotid-) Indels das Glühen stärker destabilisieren als Substitutionen? (Vielleicht verwenden wir unterschiedliche Definitionen von Indel und Punktmutation. Worüber ich gesprochen habe, sind einzelne Nukleotidinsertionen oder -deletionen. Aber keine Substitutionen.)
Was meinst du mit Indels? Ist in Ihrem Vokabular die Deletion oder Insertion einzelner Nukleotide ein Subtyp von Indel?
Ich nenne diese kleinen Veränderungen Punktmutationen (wenn wir nur ein Nukleotid gegen ein anderes austauschen, um eine andere Aminosäure zu exprimieren). Ansonsten halte ich mich an die Definition von Indel, die Sie in Wikipedia finden : "In Keimbahn- und somatischen Mutationsstudien beschreibt Indel eine spezielle Mutationsklasse, definiert als eine Mutation, die sowohl zu einer Insertion von Nukleotiden als auch zu einer Deletion von Nukleotiden führt, was zu einer Nettoänderung in der Gesamtzahl der Nukleotide, wobei beide Änderungen auf der DNA nahe beieinander liegen.
Deine Antwort verwirrt mich noch mehr. Lassen Sie uns der Klarheit halber nur über Frame-Shift- Mutationen sprechen, die durch nur eine Nukleotid-Insertion oder -Deletion verursacht werden. Haben Sie ein Zitat über einen 25 Nukleotide langen (oder kürzeren) Primer, der eine Einzelnukleotid-basierte Frameshift-Mutation in der Mitte enthält?
Ich habe keine Frame-Shift-Mutationen durchgeführt, da dies nicht im Transkriptionsfaktor auftritt und analysiert würde (es wäre embryonal tödlich). Was wir getan haben, ist die Einführung von Punktmutationen (Austausch einzelner Nukleotide gegen andere) und hier können relativ kurze Primer funktionieren (die N278D-Mutation in dem oben erwähnten Artikel wird mit einem 25mer durchgeführt).
Vielen Dank. Welcher Teil Ihrer Hauptantwort (nicht Kommentare) bezieht sich nun auf die Einzelnukleotid-basierte Frameshift- Mutation? Haben Sie zuvor mit ca. 19-22 Nukleotiden langen Primern mit Einzelnukleotid-basierter Frameshift- Mutation in der Mitte gearbeitet?

Hinzufügen einer weiteren Referenz. Diese Gruppe befasst sich mit der Wirkung verschiedener Mismatches (z. B. A>T vs. A>G) und befasst sich auch mit Positionseffekten.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass einzelne Fehlanpassungen eine Vielzahl von Effekten auslösen, die von geringfügigen (<1,5 Zyklen-Schwellenwert, z , A–A, G–A, A–G, C–C) auf PCR-Amplifikation. Es wurde eine klare Beziehung zwischen bestimmten Mismatch-Typen, Positionen und Auswirkungen gefunden.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2797725/

Mich interessierten Streichungen, nicht Substitutionen. Egal wie viel Stress das macht, die Leute schicken mir immer wieder Informationen über Substitutionen in jedem Forum.
Wirkung der Deletion oder Insertion einzelner Nukleotide auf das Primer-Annealing
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