Entwerfen von Primern mit Restriktionsstellen

Ich möchte einen Forward- und Reverse-Primer entwerfen, der Überhänge mit Restriktionsstellen enthält, wobei die DNA für das Klonen von Restriktionsenzymen verwendet wird.

Wenn ich meine DNA an eine Synthesefirma senden möchte, sollte ich den angehängten Überhang mit den Restriktionsstellen in die DNA einschließen? Spielt es eine Rolle, ob die Primer den Überhang der DNA in ihrer Sequenz haben?

Aus der Sequenz ganz am Ende, welche bp-Sequenz würde ich für meine Primer empfehlen, wenn ich ca. 20-25 bp für die Grundierung?

Siehe unten für die cDNA-Sequenz:

Schnittstelle Nde1 : 5' ... CA|TATG ... '3'

Schnittstelle Xho1 : 3'...GAGCT|C...5'

cDNA mit Überhängen mit Restriktionsstellen, Ndel1 (5'->3') und Xho1 (3'->5')

5' catatg - ATGGGTTCAAACACTTCCAAAGTGGGTGCTGGTGCAGAAAAACAACAAGTCTATACTCCG
CTAACACAGATCGATTTTTCACAGTCTTTGGTTTCTCAATTGGATTCATCGAAGGAATCA
GACTATGTCACCAAGCAAAATGCAGAAAAGTTCATTGAGAAGAAGGTTTCACAAAGGCTA
TCTAACCTAGAAGTTGAAACGTTAAAGAAGTTTGAAGATACTTTGAACAATTCACTATTA
TCAGACGACGACAAGGATGCCGTTGATGGAATATCATCAAGTTCATTGAATAATCAAATC
GAGTCGTTGAACAAGAAACTAACATTATTTGATCAATTAGAGTTACAAAAGTTGGAGAAA
TATGGGGGTGCCAAAGGTAAATCTGATAAAAAAACCGACAACGGCAGCATTTCTATAAAG
GCAAAATTGACTGAGTGTCTTTTGGCCAATAAGGGCAAGCCATTGAATTGTTACGAAGAG
ATGGAAGAATTCAAGAAGCTCGTTATGGGTTGA - gagctc 3'
Ich habe eine Antwort hinzugefügt, aber ich verstehe nicht ganz, was Sie meinen, wenn Sie sagen: > "Von der Sequenz ganz am Ende, welche bp-Sequenz würde ich für meine Primer empfehlen, wenn ich ca. 20-25 bp für haben möchte die Grundierung?" Fragen Sie uns, welche Sequenz Sie für den Rückwärtsprimer verwenden sollten?
Ja, ich wollte nur eine Idee für die Primer-Sequenz bekommen, oder im Wesentlichen, ob ich den Primer direkt am Anfang des Überhangs beginnen könnte (dh einschließlich des gesamten Überhangs).
Ihre Priming-Sequenz sollte das umgekehrte Komplement der letzten ~20 bp der codierenden Sequenz sein . Fügen Sie die Restriktionsstelle am 5'-Ende davon hinzu, dann Ihren Überhang danach. Alles in allem wird Ihr Primer 20 + 6 + 3 = 29 bp sein

Antworten (1)

Ja.

Wenn Sie beabsichtigen, das Fragment durch klassische Restriktionsenzymklonierung zu subklonieren, benötigen Sie den Überhang.

Unterschiedliche Restriktionsenzyme benötigen unterschiedlich lange Überhänge, damit sie vollständig auf dem Strang sitzen und dann die Sequenz spalten können.

NEB hat eine großartige Seite, auf der detailliert beschrieben wird, wie viele Basen für die von ihnen verkauften Enzyme benötigt werden:

https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/cleavage-close-to-the-end-of-dna-fragments

Nein, es spielt keine Rolle, ob der Überhang an anderer Stelle in der DNA erscheint, solange Ihre Restriktionsstellen dies (offensichtlich) nicht tun.

Hier sind einige Überlegungen, die ich beim Entwerfen von Primern für die PCR verwende (obwohl nicht vollständig anwendbar, wenn Sie sie nur synthetisieren lassen):

  • Verwenden Sie die 3+ Basenpaare, die die angegebene Anzahl von Nukleotiden in Ihrer Restriktionsstelle entfernt in der Sequenz darstellen, von der Sie PCRen, als Ihre Überhangsequenz, damit ein paar weitere Basen binden können. Dh

    Mit folgender Grundierung:

    Überhang – Restriktionsstelle – Priming-Sequenz

    AAA-GGATCC-ATGACATGCAGTAGC PRIMER

    ||| |||||||||||||||

    TTT--------TACTGTACGTCATCG TARGET SEQUENCE

  • Alternativ verwende ich diese etwa 3 Basenpaare, um GC-Inhalte hinzuzufügen oder zu entfernen und die Tm zu manipulieren, wenn die Annealing-Temperaturen der 2 Primer nicht ideal übereinstimmen

Danke, das macht Sinn, aber wenn die Restriktionsenzyme, die ich verwende, die Überhänge abschneiden, hinterlassen sie auch ein paar Basenpaare stromaufwärts und stromabwärts des eigentlichen Gens. Wird dies Framing-Probleme verursachen oder spielt es keine Rolle, wo das GOI eingefügt wird in einem Plasmid MCS?
Um das Framing zu korrigieren, sollten / könnten Sie Basen zwischen der Restriktionsstelle und dem interessierenden Fragment hinzufügen. Aber da Ihr NdeI-ATG im Frame mit dem Start-ATG liegt, erwarte ich keine Probleme. Sie können sogar eines dieser ATGs entfernen, wenn Sie möchten.
Ok, also soll ich TATG von 5' ... CA|TATG ... '3' (Nde1) und C von 3'...GAGCT|C...5' (Xho1) löschen? Wenn ich Basen hinzufüge, entstehen dann nicht nur stumpfe Enden?
Die einzige Sorge, die ich habe, ist der Platz, den die übrig gebliebenen Basenpaare stromaufwärts schaffen, nicht wirklich sicher, ob dies die Übersetzung beeinflussen wird
Der Überhang verschwindet, wenn Sie mit den Restriktionsenzymen verdauen. die einzige Sequenz, die bestehen bleibt, sind die Restriktionsstellen, die einen nahtlosen Einbau in Ihren Vektor ermöglichen. Die zusätzlichen Basen der Restriktionsstellen können nicht übersetzt werden, da sie vor Ihrem Startcodon und nach dem Stopcodon liegen. Wenn dies für Sie keinen Sinn ergibt, würde ich vorschlagen, sich in Sambrook et al oder einem anderen guten Lehrbuch über die Grundlagen des Klonens zu informieren.
Die Basen machen einen Unterschied, wenn Sie etwas im Rahmen mit einem Tag / Fusionsprotein oder ähnlichem klonen möchten. Auch das Ändern des Abstands zwischen dem RBS und dem Startcodon könnte die Expression ein wenig verändern.
Entwerfen von Primern mit Restriktionsstellen
AntwortenHierDatenschutz-Bestimmungen1y, 10v