Manuelles Primer-Design für ein Gen auf dem Reverse-Strang

Gar keine dumme Frage. Ich war davon genauso verwirrt wie ein Anfänger in der Molekularbiologie. Nach einer Weile hast du den Dreh raus. :)

Ich finde es viel schwieriger, Primer aus nur einem Strang zu entwerfen, insbesondere aus dem Minusstrang, also versuche ich immer, beide zum Arbeiten zu bringen. Wenn Sie darauf keine Lust haben, reicht auch nur eine Strähne (Plus oder Minus), aber ich würde in Ihrem Fall zumindest empfehlen, die umgekehrte Ergänzung zu nehmen, da Plus-Strähnen viel einfacher zu verarbeiten sind.

Nehmen wir für ein kurzes Beispiel an, ich habe eine zehn bp-Sequenz, für die ich Primer entwerfen möchte, und dies ist meine Plus-Sequenz:

5' ATAACTTCGT 3'

Nehmen wir nun an, ich möchte einen 3-bp-Primer. Der Forward-Primer wäre also einfach 5' ATA 3', das ist einfach. Die umgekehrte Grundierung wäre, wenn ich sie einfach von dort aus nehme, ohne sie umzudrehen, 5 'CGT 3'. Aber wenn ich das in meine PCR-Reaktion einbaue, wird es nichts tun, weil die DNA an ihren Komplementstrang bindet, was bedeutet, dass der Primer nur an 3' ACG 5' oder 5' GCA 3' binden würde. Also werde ich stattdessen 3' ACG 5' wollen, weil es an sein Kompliment, den 5' CGT 3'-Teil meiner Sequenz, binden wird. (Technisches Problem hier, Lieferanten bieten normalerweise nur die Möglichkeit, in 5 'bis 3' zu schreiben, was sinnvoll ist, aber Sie müssen daran denken, Ihre Rückwärtsgrundierung umzudrehen, bevor Sie sie ihnen geben, da sie ursprünglich in 3 'bis 5' sein wird. In diesem Fall würde ich um 5' GCA 3' bitten.)

Dies ist jedoch einfacher zu visualisieren, wenn ich sowohl den Plus- als auch den Minusstrang habe, der so aussehen würde:

5' ATAACTTCGT 3'
3' TATTGAAGCA 5'

Wenn Sie wie im obigen Beispiel beide Stränge haben, können Sie sowohl den Vorwärts- als auch den Rückwärtsprimer ohne große Schwierigkeiten finden.

Ich könnte eine umfassendere Antwort darauf geben, wie das alles während der DNA-Replikation abläuft, die Illustrationen, Allegorien und vielleicht ein paar leicht humorvolle Witze beinhalten würde, aber ich würde es hassen, Sie unnötig zu langweilen, also lassen Sie mich wissen, ob Sie es jetzt verstehen oder wenn Du brauchst mehr. ;)

Edit: Genau (zu deinem dritten Kommentar meine ich)! Denken Sie daran, dass DNA immer von 5' nach 3' gelesen und repliziert wird, sodass der Vorwärtsprimer an den Minusstrang bindet und von 5' nach 3' repliziert wird, wodurch die Sequenz nach rechts verlängert wird. Der Reverse-Primer ist das Gegenteil, 3' bis 5', also verlängert er den Plus-Strang nach links. Nachdem beides passiert ist, haben Sie am Ende zwei volle Stränge. Wie versprochen, hier eine Illustration:

Nun zu Ihrer Frage zu Primer-BLAST. Sie müssen keinen Plus-Strang eingeben, aber das Tool geht davon aus, dass Sie den Plus-Strang eingeben, damit Sie die richtigen Primer erhalten, es nennt ihnen nur die falschen Namen (d. h. mit dem obigen Beispiel würde es Ihnen geben 5' GCA 3' als Vorwärtsprimer und 5' ATA 3' als Rückwärtsprimer). Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer werden genau gleich behandelt, sodass dies Ihre PCR nicht stören würde, aber dennoch falsch wäre. Um Verwirrung zu vermeiden, schlage ich vor, ein Tool zu verwenden, um Ihre Minus-Sequenz in Plus umzukehren, bevor Sie es ausführen. Es ist ziemlich einfach, das umgekehrte Kompliment einer beliebigen Sequenz zu erhalten; Hier ist ein gutes Tool dafür.

Ich hoffe das hilft. :)