Wie unterschiedlich kann die Tm zwischen 2 Primern sein?

Ich habe eine Vorwärtsgrundierung mit Tm 85 Grad Celsius. Ich kann diese Grundierung nicht ändern. Aber ich habe zwei Möglichkeiten für die Rückwärtsgrundierung. Eine mit Tm 65 Grad Celsius (Glühen bei 65 Grad Celsius) und eine andere mit 72 Grad Celsius (Glühen bei 72 Grad Celsius). Zunächst einmal, wird einer der Primer für mich funktionieren? Wenn ja, welches Paar wäre besser?

Sie sollten sich beim Hersteller Ihres PCR-Kits erkundigen. Ich benutze NEB und ihr Online-TM-Rechner warnt Sie, wenn die TM-Differenz größer als 5 ° C ist, was darauf hindeutet, dass eine Differenz von 5 ° C oder weniger am besten ist.
Ganz einfach: Probieren Sie beides aus.

Antworten (2)

Der von "Primer-Blast" bereitgestellte Standardparameter ist 3 Grad (maximaler Unterschied zwischen den Schmelztemperaturen der Paare). Das heißt, ich denke, es hängt wirklich von der Anwendung ab. Beim Klonen (meiner Erfahrung nach) können Sie größere Delta-Tm-Bereiche zwischen den Primern zulassen (in diesem Fall habe ich früher die durchschnittliche Tm der beiden Primer als Annealing-Temperatur verwendet). Sie akzeptieren eine schlechte Effizienz, aber schließlich können Sie Ihr Insert aus dem Gel herausziehen und es in einen Vektor für eine Präparation klonen.

Danke Pedrini. Dies ist der Fall beim Klonen. Mit all Ihren Vorschlägen werde ich es einfach mit den gleichen Grundierungen versuchen.
@RKK was meinst du mit "mit den gleichen Primern"? Wenn keine der beiden Rückwärtsrichtungen funktioniert, können Sie sogar eine umgestalten, indem Sie sie bei 3' verlängern, um sie an die Tm der Vorwärtsrichtung anzupassen.

Dies hängt wirklich von Ihrer Anwendung ab, aber meiner Erfahrung nach funktionieren normalerweise 2-3 Grad mit maximal 5 ° C Unterschied. Je mehr sich die Schmelztemperaturen unterscheiden, desto mehr müssen Sie alle anderen Parameter wie Salz- und Magnesiumkonzentration, Enzymmenge, Glüh- und Elongationszeiten usw. optimieren.

85°C Schmelztemperatur erscheinen mir sehr viel, da Sie 13°C über der optimalen Arbeitstemperatur der Taq-Polymerase liegen. Dies wird höchstwahrscheinlich zu vielen Nebenprodukten mit unvollständig gebundenen Primern führen. Sie können die Glühtemperatur ändern, indem Sie das 3'-Ende Ihrer Grundierung kürzen (ich nehme an, dass Sie einen bestimmten Startpunkt benötigen), damit Sie zumindest ein wenig nach unten kommen. Dann würde ich wahrscheinlich beide anderen Grundierungen bestellen und testen, welche besser funktionieren, aber ich würde nicht erwarten, dass dies sofort funktioniert und zumindest etwas Optimierung benötigen wird.

Können Sie weitere Informationen geben, warum Sie keine anderen Grundierungen verwenden können und zu Ihrer Anwendung?

Danke, Chris. Ich kann meinen Forward-Primer nicht ändern, da er eine Restriktionsstelle am 5'-Ende und eine Punktmutation nahe dem 3'-Ende enthält. Ich denke, ich muss es einfach ausprobieren und mit den Parametern spielen. Ich werde kommentieren, sobald ich mein Experiment gemacht habe. Ich freue mich über weitere Vorschläge.
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