Es ist mir ein wenig peinlich zu fragen, aber wenn Sie beispielsweise vier degenerierte Primer haben und das Endprotokoll besagt, dass die endgültige Primerkonzentration 10 µM Arbeitsmaterial betragen sollte, sollten Sie die Primer 10 µM insgesamt (jeweils 2,5 µM) oder 10 µM für jeder degenerierte Primer?
Sie können einfach 2 µl von jeder Arbeitslösung (10 µM) zu Ihrem PCR-Mix von 20 µl hinzufügen.
Sie können dieses Protokoll überprüfen.
Achtung : Der Autor hat verwendet
anstatt
Er verwendet 5 &mgr;l von jedem Primer (20 &mgr;M) in einer 50 &mgr;l-Reaktion. Das ist das Doppelte von dem, was ich erwähnt habe. IMO ist es am besten, es mit einer niedrigeren Konzentration zu versuchen und sie dann gegebenenfalls zu erhöhen. Überschüssige Primerkonzentration kann zu unspezifischer Bindung und Amplifikation führen, wenn die Primer nicht perfekt gestaltet sind.
Von dieser Seite:
Verwendung von degenerierten Primern
Da ein degenerierter Primer eigentlich eine Mischung aus verschiedenen Primern ist, funktioniert nur ein Bruchteil des degenerierten „Primers“ tatsächlich in der PCR. Man müsste daher die Primerkonzentration in PCR, Sequenzierungsreaktionen usw. erhöhen. Wenn ein Primer 8-fach degeneriert ist, sollte die Konzentration 4-8-fach erhöht werden und so weiter. Für höhere Degenerationen, z. B. 64-fach, kann man die Primerkonzentration jedoch nicht 64-fach erhöhen und müsste sein Glück nur mit einer 5-10-fachen Erhöhung versuchen.