Warum sollten Sie eine Annealing-Temperatur von etwa 5 °C unter der Tm Ihrer Primer verwenden?
Nach meiner aktuellen Forschung denke ich, dass es etwas mit den anderen Reaktanten in der PCR zu tun hat, aber ich bin mir nicht sicher.
Sie möchten Primer haben, die unter den Reaktionsbedingungen nur an Ihre interessierende Sequenz binden. Wenn Sie zu weit von der optimalen Anlagerungstemperatur abweichen (5 °C unter der Tm ist meiner Erfahrung nach tatsächlich eine relativ gute Wahl), wird dies die PCR-Effizienz und damit die Ausbeute Ihrer Reaktion beeinträchtigen.
Eine viel zu niedrige Annealing-Temperatur ermöglicht ein Annealing Ihrer Primer an anderen Stellen als Ihrem beabsichtigten Ziel mit partiellem Annealing oder internen Basenfehlpaarungen. Dies führt zu einer unspezifischen Amplifikation und geringeren Ausbeuten.
Wenn die Annealingtemperatur zu hoch ist, kann keine Primerbindung stattfinden und Sie erhalten kein PCR-Produkt. Alternativ kann eine teilweise Bindung auch zu falsch grundierten Produkten führen, obwohl dies viel weniger wahrscheinlich ist, als überhaupt kein Produkt zu erhalten.
Die Annealingtemperatur eines Primers ist definiert als die Temperatur, bei der 50 % der Nukleotide des Primers an die DNA gebunden sind. Ein Glühanteil von 50 % ergibt kein optimales PCT-Produkt. Durch Absenken der Temperatur um etwa 5 °C ändert sich der Anteil des gebundenen Primers auf mehr als 50 % (vielleicht etwa 70 - 80 %), wodurch eine genauere Ausbeute erzielt wird.
Deshalb ziehen wir 5oC von der theoretischen Glühtemperatur ab.
Chris
A. Radek Martínez
Chris