Polymerase Cycle Assembly (PCA) funktioniert nicht (Nur Primer in EF Gel)

Hallo zusammen 👋!

Ich arbeite daran, dsDNA-Fragmente (für die weitere Domestizierung des Goldenen Tors) über die Polymerase-Zyklus-Assemblierung (PCA) zusammenzusetzen. Nach dem Entwerfen der erforderlichen Oligonukleotide mit Überlappungsregionen. (Bild des Designs unten bereitgestellt). Verwenden

NZYProof Green Mastermix x2 25 ul Innere Oligonukleotide 2 ul von 1 uM Vorrat Äußere Oligonukleotide 2 ul von 100 uM Vorrat

Anfängliche Denaturierung 95 ºC 2 min Denaturierung 95 ºC 30 s Annealing 62 ºC 30 s Verlängerung 72 ºC 30 s Wiederholt in 25 Zyklen Endverlängerung 72 ºC 2 min

Olinukleotid-Design für die PCA-Assemblierungsreaktion

Nach Durchführung des folgenden Protokolls (basierend auf This one ) mit einem High-Fidelity-Polymerase-Mastermix zeigt das EF-Gel der PCR-Produkte nur eine einzige "Bande", die den in die Reaktion eingeführten Oligonukleotiden entspricht. (Ignorieren Sie das unscharfe EF-Gel, es wurde ziemlich lange nach dem Lauf des Gels abgebildet).

EF-Gel

Irgendeine Idee, was eigentlich schief laufen könnte? Sollte ich nicht zumindest einige schwache Amplikons mit höherem Molekulargewicht beobachten?

Danke im Voraus für eure Antworten!

Jörg.

UPDATE: In Bezug auf die Länge der Überlappungsregionen berücksichtigt das Design unterschiedliche Längen der Überlappungssequenzen, um ungefähr die gleiche Tm für alle überlappenden Regionen zu erreichen. Tm jeder Überlappung wurde mit dem Online-Tool NEB Tm Calculator berechnet, und alle liegen im Bereich von 61–63 °C (unter Berücksichtigung eines Q5-Mastermix, der der HiFi-Polymerase am nächsten kommt, die wir derzeit verwenden)

UPDATE2: Nach dem Versuch des PCA-Verfahrens mit einem „Touchdown“-Ansatz (stufenweises Reduzieren der Glühtemperatur nach 3 aufeinanderfolgenden Zyklen) zeigen die meisten Baugruppen deutliche Banden der gewünschten Länge im EF-Gel. Glühen ist ein entscheidender Parameter für PCA.

Ich habe gerade die Rot/Rechts-Grau-Primer-Überlappungssequenz (gtgaggacgaaacagcctctacaaataatt) durch den NEB-Tm-Rechner unter tmcalculator.neb.com/#!/main laufen lassen und eine vorhergesagte Tm von 68 °C erhalten.
Ja! Das stimmt eigentlich. Das bereitgestellte Bild ist die einzige PCA-Baugruppe, die eine seltsame Überlappung von höheren Tm aufweist. Die verbleibenden (die anderen beiden Bahnen des EF-Gels) sind jedoch andere Sequenzen, bei denen alle überlappenden Regionen zwischen 61 und 62 ° C der Schmelztemperatur liegen.

Antworten (1)

Ich vermute eine Fehlzündung, weil die Glühtemperatur im Vergleich zur vorhergesagten Schmelztemperatur der Überlappungsregionen zu niedrig ist. Wie das Protokoll in Ihrem Link feststellt:

(3) Wählen Sie die Glühtemperatur mit Bedacht. Wir empfehlen, das gleiche wie min_Tm von Primerize Design zu verwenden, das normalerweise zwischen 60 und 64 °C liegt.

(4) Überprüfen Sie das PCR-Produkt auf 4 % Agarosegel. Wenn die Montage mit kürzeren Fehlzündungsprodukten nicht erfolgreich ist, empfehlen wir, die Glühtemperatur zu erhöhen, um Fehlzündungen zu reduzieren. Alternativ können Sie die Baugruppe in separate Unterpools aufteilen (dh Primer 1–4 und Primer 5–6) und eine zusätzliche Runde der vollständigen Assemblierung durchführen (siehe unten).

Auf den ersten Blick verwendet die Probenanordnung im verknüpften Protokoll Überlappungsregionen ähnlicher Länge (vermutlich auch mit ähnlicher vorhergesagter Schmelztemperatur), während Ihre Überlappungen in der Länge erheblich variieren (insbesondere rote Grundierung und untere rechte graue Grundierung).

Unter Verwendung der NEB-Tm-Rechnerseite ( tmcalculator.neb.com/#!/main ) erhielt ich die folgenden vorhergesagten Tms:

linke graue/rote Primer-Überlappungssequenz (ctttccggtctgatgagt) Tm 61C

rote/rechte graue Primer-Überlappungssequenz (gtgaggacgaaacagcctctacaaataatt) Tm 68C

grüne/linke graue Primer-Überlappungssequenz (gctcgtataatgtgtggaag) Tm 60°C

Basierend auf der viel höheren Tm der Überlappung von Rot / Rechtsgrau würde ich Ihre Reaktion mit Glühtemperaturen von 65 ° C und 68 ° C wiederholen.

Vielen Dank für Ihren Rat Armand, wir werden versuchen, es so zu machen und die Ergebnisse zu überprüfen. Es ist jedoch immer noch seltsam für uns, kein anderes Produkt mit höherem Molekulargewicht als die Primer selbst zu finden.
Möglicherweise liegt ein allgemeineres Problem mit Ihrer PCR-Reaktion vor. Es kann hilfreich sein, eine positive Kontrollreaktion durchzuführen, wenn Sie eine herkömmliche PCR durchführen, wobei 2 Primer ein Segment von einer Vorlage amplifizieren. Das verknüpfte Protokoll schlug auch vor, die Reaktion in 2-Primer-Segmente zu zerlegen und dann eine letzte Reaktion durchzuführen, um diese überlappenden Segmente zusammenzubauen. Ich stimme zu, dass das Fehlen von Produkten in einer Ihrer Reaktionsbahnen darauf hindeutet, dass es sich nicht nur um ein Problem mit einer Sequenz handelt.
Ich habe in der Vergangenheit Erfahrungen mit unreinen Primerpräparaten gemacht, die die Reaktion hemmten, mit Herstellungsrückständen auf Vertiefungen, die die Reaktion hemmten, und so weiter. Positive Kontrollreaktionen, mit denen Sie überprüfen können, ob alle Reaktionskomponenten und -bedingungen funktionieren, können zu einer schnelleren Fehlersuche beitragen.
Tatsächlich haben wir bereits versucht, andere PCR-Amplifikationen durchzuführen, und diese Reaktionen waren erfolgreich. Scheint nicht am PCR-Mix oder an Verunreinigungen in den Röhrchen zu liegen. Wir haben auch eine "PCA" mit nur 2 überlappenden Primern durchgeführt, und die Ergebnisse waren ähnlich wie die hier veröffentlichten. Ich fange an zu glauben, dass unser HiFi-Polymerase-Puffer im Vergleich zu NEB Q5 (näher an Phusion-Polymerasen) zu niedrigeren Schmelztemperaturen führt, also könnte es sich vielleicht lohnen, es mit einem Toucdown-PCA zu versuchen.
Könnte auch sein, dass die Auflösung des EF-Gels nicht ausreicht und der "unscharfe Fleck" mehrere Banden sind. Wir werden versuchen, die Produkte erneut auf einem gut funktionierenden 4%igen Agarosegel laufen zu lassen und die Ergebnisse zu sehen. Wir planen auch, eine zweite PCR nur mit äußeren Primern durchzuführen, wobei das frühere PCR-Produkt als Matrize verwendet wird, und zu sehen, ob eine Amplifikation auftritt. Wir werden diesen Thread auf dem Laufenden halten. Vielen Dank für all die klugen Ratschläge, Armand!
Es scheint, als hätten Sie alles abgedeckt - viel Glück! Ich weiß, wie frustrierend es sein kann, wenn eine vermeintlich einfache Reaktion nicht funktioniert.
Polymerase Cycle Assembly (PCA) funktioniert nicht (Nur Primer in EF Gel)
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