Gencluster von Interesse, der nicht in PCR amplifiziert wird

In einem Labor habe ich derzeit eine Probe von Rhizobium sp. NT-26. Dieses Bakterium ist ein chemolithoautotropher Arsenitoxidierer, und ich möchte die Arsenitoxidase-Gene in einen anderen Bakterienstamm klonen, in der Hoffnung, diese Gene zu exprimieren und mehr über Arsenitoxidation und -resistenz zu erfahren. Mein erster Schritt dieses Experiments bestand darin, die Plasmid-DNA einer NT-26-Kolonie zu reinigen, die ich auf einer TSA-Platte gezüchtet hatte. Dafür habe ich das Omega Bio-teK EZNA Plasmid-Mini-Kit I verwendet. Nach der Verwendung des Kits blieben mir 40 Mikroliter Plasmid-DNA-Lösung übrig. Danach wollte ich die interessierenden Gene durch PCR amplifizieren. Die Sequenz dieses Genclusters ist hier auf NCBI Nucleotide aufgeführt: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY345225. Meine größten Herausforderungen für dieses Projekt sind das Entwerfen der richtigen Primer für die korrekte Amplifikation und die Tatsache, dass diese Sequenz 9 Kilobasen lang ist, also würde ich eine High-Fidelity-Taq-Polymerase-Mischung benötigen. Das Hauptproblem, auf das ich mich konzentrieren werde, ist das Design der Primer. Zum einen wusste ich, dass ich diesen Gencluster in einen Plasmid-Expressionsvektor für die Elektroporation in einen Stamm von E. coli klonen würde. Aus diesem Grund beschloss ich, dass ich meine Primer mit bereits angebrachten Restriktionsstellen entwerfen wollte. Um es kurz zu machen, ich habe insgesamt 17 Mal PCR versucht, und ich habe in der Elektrophorese nicht die richtige Sequenzlänge gefunden. Ich habe PCR mit vielen Variationen im Programm und verschiedenen anderen Änderungen ausprobiert und bin zu dem Schluss gekommen, dass mit meinen Primern etwas nicht stimmt. Ich möchte auf die Details des Projekts eingehen,

Die Gensequenz, die ich amplifizieren möchte, besteht aus insgesamt 6 Genen. Die ersten vier Gene sind aroB, aroA, cytC und moeA1 (Santini et al.2010). Diese Gene befinden sich in einem Gencluster. Die anderen beiden Gene sind stromaufwärts, und sie sind AroS und aroR. Diese beiden Gencluster bilden ein Zweikomponenten-Signaltransduktionssystem, das für die autotrophe Oxidation von Arsenit kodiert. In ihrer Originalveröffentlichung fügte Dr. Joanne Santini den Link zur Sequenz aller 6 Gene auf NCBI Nucleotide hinzu. Ich habe den Link im obigen Absatz aufgeführt. Ich habe den Genome Compiler von Addgene aufgerufen und die genaue Sequenz von NCBI gefunden, und ich habe unten einen Screenshot davon eingefügt. Aus irgendeinem Grund beginnen die eigentlichen Gene, an deren Amplifikation ich interessiert bin, nicht am Anfang der Sequenz auf NCBI. Stattdessen beginnt das erste Gen, aroS, beim 424. Nukleotid. Von den Nukleotiden 1-423 listete der Genome Compiler dies als "unbekannt" auf. Aus diesem Grund habe ich beschlossen, diese Nukleotide loszuwerden, und verstärken Sie einfach den Rest davon. Dasselbe geschah am Ende der Sequenz, wo das letzte Gen, moeA1, bei Nukleotid 8.263 aufhörte. Von da an listete der Genome Compiler den Rest als "unbekannt" auf. Ich habe mich entschieden, mich nicht mit den unbekannten Regionen zu befassen und nur die Gene zu verstärken, an denen ich interessiert bin.

Das erste Gen dieser Sequenz, aroS, beginnt mit ATGAGCCTTCTCGAGC . Ich weiß, dass zum Entwerfen von Primern der Vorwärtsprimer mit der Anfangssequenz des interessierenden Gens übereinstimmen sollte. Aus diesem Grund enthielt der Vorwärtsprimer ATGAGCCTTCTCGAGC . Da ich es in einen Vektor pBAD30 klonte (die Karte ist hier aufgelistet https://www.addgene.org/vector-database/1847/ ), wollte ich dem Forward-Primer eine Restriktionsstelle hinzufügen. Ich fand, dass kpnI für meine Sequenz funktionieren würde. Die Sequenz von kpnI ist "GGTACC", also habe ich sie zu meinem Forward-Primer hinzugefügt. Der Primer ist bisher folgendermaßen typisiert: GGTACC ATGAGCCTTCTCGAGC. Ich habe auch gelernt, dass am Anfang der Fibel eine Sitzsequenz hinzugefügt werden sollte, also habe ich dem beginnenden „GTAT“ willkürlich vier Buchstaben hinzugefügt. Nach all diesen drei Hinzufügungen lautet meine endgültige Vorwärts-Grundierung GTATGGTACC ATGAGCCTTCTCGAGC . Beim Entwerfen der Rückseitengrundierung bin ich mir nicht ganz sicher, ob mein Entwurf korrekt ist. Die letzten 18 Basen für das letzte Gen, moeA1, sind GAACCGTCCGCAATGTGA . Ich wusste, dass der umgekehrte Primer ein umgekehrtes Kompliment sein sollte, also fand ich das umgekehrte Kompliment TCACATTGCGAACGGTTC . Was meine Restriktionsseite betrifft, habe ich mich für xmaI entschieden. Die Sequenz für xmaI ist "CCCGGG", also habe ich diese Sequenz zu meinem Reverse-Primer hinzugefügt. Die bisherige Sequenz ist CCCGGG TCACATTGCGAACGGTTC. Genau wie beim letzten habe ich die Basen "GATA" als Sitzsequenz hinzugefügt. Die letzte Reverse-Primer-Sequenz ist "GATACCCGGG TCACATTGCGAACGGTTC ".

Nachdem ich beide Primer entworfen hatte, fügte ich diese Sequenzen in Integrated DNA Technologies ein und bestellte Primer in Lösung (100 mM mit IDTE). Für ein PCR-Kit habe ich das Expand Long Range dNTPack von Millipore-Sigma verwendet. Dieses PCR-Kit enthielt Enzyme, Nukleotide und alle für die PCR erforderlichen Puffer.

Nachdem die Primer geliefert wurden, habe ich ein paar Mastermixe für die PCR angesetzt. Ich habe die Anweisungen des Herstellers zum Einrichten der Mastermixe und des Programms befolgt ( https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Roche/Bulletin/1/elongnrobul.pdf). Der Schmelzpunkt meines Forward-Primers war 60,5°C und der Schmelzpunkt meines Reverse-Primers war 64,4°C. Aus diesem Grund habe ich eine Glühtemperatur von 57,5 ​​°C gewählt. Ich bin etwas besorgt über den Unterschied in der Schmelztemperatur und die Auswirkungen, die er auf das Glühen haben könnte, und mir ist jetzt klar, dass ich den GC-Gehalt beider Primer hätte anpassen können, um näher liegende Schmelztemperaturen zu erzeugen. Ich glaube aber nicht, dass das an der fehlenden Verstärkung liegt. Eine Sorge, die ich in Bezug auf meine Mastermixe habe, ist, dass ich die DNA-Konzentration in der gereinigten Plasmidlösung nicht kenne. Jeder Mastermix sollte bis zu 500 ng DNA enthalten, aber ich habe 1-8 ul DNA-Lösung in jedem Mastermix verwendet. Könnte es eine Möglichkeit von zu viel DNA geben? Zu klein? Ich habe viele verschiedene Varianten ausprobiert und keine hat funktioniert. Hauptsächlich, jeder Mastermix hat 3 ul des gegebenen DMSO verwendet. Bei meinem 17. PCR-Lauf habe ich irgendein Ergebnis erhalten. Wie ich bereits erwähnt habe, habe ich nicht mit den unbekannten DNA-Regionen herumgespielt, also sollte unsere endgültige Sequenz der 6 Gene etwa 7,8 Kilobasen lang sein. Nach der PCR ließ ich es unter einem Gel laufen, und das sah ich:

In der dritten Spur waren die DNA-Banden am hellsten. Überraschenderweise fügte ich für die dritte Spur eine Kolonie unserer Bakterien zum Mastermix für die DNA-Quelle hinzu, und es entstand eine Bande. Die meisten Bahnen zeigen eine DNA-Bande, aber die Banden sind nicht ganz in der 7,8-kb-Region, daher denke ich, dass es nicht unser gewünschtes Produkt ist. Könnte dies möglicherweise unser Produkt sein, aber Verunreinigungen verlangsamten die Reise der DNA? Wenn ja, würde ich gerne wissen, ob ich mit dem Restriktionsverdau des Inserts und pBAD30 und dann der Ligation fortfahren sollte.