Echtzeit-PCR-Verzögerung in Cq aufgrund der Insertion von SNP in den Primer

Ich sammle Beweise, sogar anekdotische, wie sich die Deletion oder Insertion einzelner Nukleotide in der Primerregion auf das Ergebnis der Echtzeit-PCR auswirkt. Am meisten interessiert mich, wie stark der Cq (Zyklusschwellenwert) im Vergleich zu einem perfekt abgestimmten Primer verzögert ist. Aber wenn Sie keine Cq-Daten haben, sammle ich auch „Ja oder Nein“-Antworten, die sagen, ob es eine Verstärkung oder keine Verstärkung gab.

Ich interessiere mich speziell für Insertion- oder Deletion-Mismatches. (Für Substitutions-Mismatches gibt es viele Daten.)

Ich freue mich über veröffentlichte oder unveröffentlichte Beweise.

Wo ist die Einfügung vom 3'-Ende? Die Primer-Effizienz wird beeinträchtigt, wenn Punkt-Indels eingeführt werden. Wenn es am 3'-Ende eine Fehlpaarung gibt, kann es sein, dass die Verlängerung überhaupt nicht stattfindet. Was die Daten betrifft, wird niemand absichtlich einen RT-Primer mit Fehlpaarungen entwerfen, es sei denn, er forscht zur Primereffizienz. : P
Die Insertion befindet sich an Position 9 vom 3'-Ende und die Primerlänge beträgt 19. Der Primer wurde entwickelt, um 2 verwandte Pflanzenarten zu unterscheiden, eine sollte amplifiziert werden, während die andere aufgrund von Insertionsfehlpaarung nicht sein sollte. Ich denke, dass die Autoren falsch liegen und dass eine Streichung an einer solchen Position nicht ausreicht, um Arten zu diskriminieren. Aber ich bitte die Leute um empirische Daten, möglicherweise etwas, das ich zitieren kann.
Diese Frage ist mit meiner vorherigen verbunden ( biology.stackexchange.com/questions/14357/… ), ist aber jetzt etwas anders. Bevor ich nach der Schmelztemperatur gefragt habe, aber jetzt weiß ich, dass die Verzögerung des Cq-Werts der Parameter ist, nach dem ich suche (und nicht mit Tm korreliert).
Sie können nicht genau zwischen den Arten unterscheiden, wenn Ihre Punktabweichung innerhalb der Grundierung liegt. Die Sequenzierung ist am besten, aber Sie sollten einen Primer verwenden, der stromaufwärts der variablen Region bindet. Die Primereffizienz ändert sich mit der Nichtübereinstimmung, was sich wiederum auf den Ct-Wert auswirkt, aber es gibt keine direkte Korrelation zwischen der Anzahl der Nichtübereinstimmungen und Ct.
@ WYSIWYG Beispiel für die Unterscheidung von Walnuss und Pekannuss durch 4 Fehlpaarungen in der umgekehrten Grundierung. Aktuelle Studie über verschiedene Korrelationen zwischen der Anzahl der Mismatches und Delta Ct (und anderen Korrelationen anderer Parameter). Ich erwarte keine ähnlich gründliche Studie über Lösch-Mismatches, ich sammle nur anekdotische Beweise.

Antworten (1)

Wie @WYSIWYG betonte, kann es informativ sein, den Indel-Unterschied am 3'-Ende zu haben, aber es fällt mir schwerer, Beweise in der Mitte der Grundierung zu finden. Das Anbringen der Mutation/Indel am 3'-Ende ändert das ΔCT. Um dies gut zu machen , benötigen Sie eine breite Abdeckung Ihrer Mutationsseite.

Ich denke, dass es möglich ist, dass es bei einer Nichtübereinstimmung in der Mitte einer Grundierung einen Unterschied geben könnte, aber es wäre nicht so offensichtlich, als wäre es näher am 3'-Ende. Es sei denn, es gab einen ernsthaften Grund, warum Sie es nicht dort platzieren konnten (dh Tm unter 45 in der Referenz), das klingt nach schlechtem Primer-Design.

Ich werde anmerken, dass ich sicherlich kein qPCR-Experte bin, und ich glaube nicht, dass die Frage direkt untersucht wurde (wie Sie vermutet haben). Als ich zuvor nach Indels gesucht habe (hatte einige interessante Sachen mit HLA-Typen gemacht ...), haben wir größere Primer für die qPCR verwendet.

Wenn dies Ihre Frage nicht zufriedenstellend beantwortet, gibt es eine erste Referenz, die wir uns ansehen sollten? Ich stelle mir vor, dass Dinge wie gutes Löschen und andere Faktoren beim Vergleich von zwei Vorlagen (eine mit Indel und eine ohne) eine gewisse Bedeutung haben könnten, aber auch hier ist es irgendwie seltsam, die Mutation in die Mitte zu stellen.

Bearbeiten Sie die Kommentare: 1: Ich denke, die Cq-Verzögerung wird von Dingen wie Länge, Sequenz und Mutation abhängen. Möglicherweise gibt es eine Formel / einen Algorithmus für ein großes Schema, um die Verzögerung vorherzusagen, aber ich kenne keine und ich konnte sie nicht finden, falls sie existiert. Die meisten Grafiken und Unterschiede, die ich gesehen habe, waren groß genug, um mich davon zu überzeugen, dass sie signifikant sind. Ich weiß nicht, ob das wie ein Flow ist, wo man den ganzen Tag sitzen und über die biologische Relevanz von 40% bis 30% einer bestimmten Gruppe streiten kann.

2: Tut mir leid, dass ich keine Zeit hatte, hereinzukommen und eine angemessene Zusammenfassung davon zu geben. Sie sind, wie Sie betont haben, tangential zu dem, was Sie zu tun versuchen, aber tatsächlich gehen sie das Problem durch ihre Methoden an. Ich werde versuchen, ein besseres Summery zu machen, sobald ich Zeit habe (ich habe ein Stipendium, ich versuche, bis Dienstag fertig zu werden, also wahrscheinlich danach). Wenn Sie der Frage Erläuterungen hinzufügen möchten, tun Sie dies bitte.

3: Dies ist möglicherweise aus der allgemeinen Wahrnehmung heraus entstanden, dass es notwendig war und dass ich nach der höchsten Tm strebe, die ich im Allgemeinen erreichen kann, ohne dass Strukturprobleme eingeführt werden. Ich habe auch den Luxus, mir keine Gedanken über die Kosten von Ulta-mers machen zu müssen. Es könnte auch aus der Geschichte der Arbeit in BACs vor Jahren stammen. Längere Zündhütchen haben meine Erfolgsraten immer erhöht, wenn ich Kassetten ausknockte.

Ich dachte nur, es muss manchmal passieren, dass der Primer entworfen wird, ohne alle möglichen Varianten des Zielgens zu kennen. Und manchmal, glaube ich, wird versehentlich entdeckt, dass es eine einzelne Nukleotiddeletion oder -insertion zwischen Primer und Variante (Allel) der Matrize gibt. Ich hoffte, dass jemand bei seiner Arbeit auf so etwas gestoßen ist und mir sagen kann, wie stark Cq verzögert war. (Oder im klassischen PCR-Setup, ob es eine Amplifikation gab oder nicht). Die Artikel, auf die Sie mich verwiesen haben, scheinen relevant zu sein, obwohl sie meine Frage nicht genau beantworten.
Weißt du, ich habe keine Zeit, alle Artikel zu lesen, bevor mein Kopfgeld abläuft. Sie scheinen meine Frage nicht genau zu beantworten, aber sie sind relevant, und ich konnte sie vorher selbst nicht finden. Und ich möchte das Kopfgeld nicht verschwenden ... Also lass es deins sein, aber vielleicht siehst du, wie ich später dieselbe Frage anders stelle. Was ich sowieso tun sollte, weil die meisten Leute davon verwirrt zu sein scheinen.
Woher wussten Sie, dass Sie größere Primer verwenden müssen, wenn Sie eine Indel-ähnliche Punktmutation einführen? Woher kommt diese ursprüngliche Empfehlung?
@Barbara Entschuldigung, ich habe mich gerade angemeldet und Ihre Kommentare bemerkt. Ich habe versucht, Ihre Kommentare zumindest etwas anzusprechen. Ich muss zurückkommen, um sie weiter anzusprechen, sobald ich Zeit habe.
1. „Ich weiß nicht, ob das so ein Flow ist, wo man den ganzen Tag sitzen und über die biologische Relevanz von 40% bis 30% einer bestimmten Gruppe streiten kann.“ - Ich habe diesen Satz nicht verstanden. 2. "Tut mir leid, dass ich keine Zeit hatte, herzukommen und eine angemessene Zusammenfassung davon zu geben" - ich wollte nicht sagen, dass es in Ihrer Verantwortung liegt, zusammenzufassen (sollte man es auf dieser Seite tun?), Zusammenfassen hilft sicherlich, aber Für direkte Zitate bin ich sehr dankbar.
@Barbara zu: 1, nehmen wir an, Sie haben eine wiederholbare Veränderung von 5-15% in einer Population durch Durchflusszytometrie. Statistische Signifikanz kann man sicherlich durch große Akquisitionen und viele Wiederholungen erreichen, aber je nach biologischem Hintergrund kann dies biologisch signifikant/relevant sein oder auch nicht.
Okay, danke für die Erklärung. Das ist nicht die Art von Arbeit, die ich mache. Es ist eher so, als müsste ich per qualitativer Real-Time-PCR feststellen, ob Schokolade Spuren von Walnuss oder Pekannuss enthält.
Echtzeit-PCR-Verzögerung in Cq aufgrund der Insertion von SNP in den Primer
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