Ich versuche, eine schnelle Methode zu entwickeln, um genomische DNA aus menschlichen Zellen für eine PCR zu extrahieren.
Zuerst sammelte ich Zellen durch Zentrifugieren von Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) und extrahierte genomische DNA mit einem Kit, gefolgt von einem PCR-Protokoll, das gut funktioniert, aber ein ziemlich langwieriger Prozess ist.
Ich versuchte, die Methode abzukürzen und entfernte die DNA-Extraktionsschritte, indem ich pelletierte Spuckproben als Template für die PCR verwendete und den anfänglichen Denaturierungsschritt von 3 Minuten auf 5 Minuten verlängerte. Diese Methode war jedoch nicht zuverlässig, da einige meiner Proben amplifiziert wurden und andere nicht.
Kann mir hier jemand ein zuverlässiges Protokoll vorschlagen?
Danke!
Ich bin mir meiner Antwort nicht sicher, aber der unten verlinkte Artikel enthält Methoden zur DNA-Extraktion verschiedener menschlicher Probentypen (Blut, Haare, Urin, Wange).
Meine Professoren haben mir immer gesagt, dass die DNA-Extraktion eher eine Kunst als eine Wissenschaft ist und man basteln muss, um es genau richtig hinzubekommen.
Vielleicht könnten Sie für etwas wirklich Schnelles einen Protienase-K-"Squishing-Puffer" ausprobieren und ihn dann etwa 10 Minuten lang im Puffer kochen und dann versuchen, PCR durchzuführen. Ich bin nur ein Student, also nimm meine Worte mit einem schweren Körnchen Salz.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3792701/
So haben sie die Wangenproben entnommen: Wangenabstriche:
Fünf gesunde erwachsene Freiwillige wurden rekrutiert (Altersgruppe 22–35 Jahre) und demografische Informationen, einschließlich Alter, Gesundheitszustand, Geschlecht, Abstammung der Bevölkerung, Haarfarbe und Haarbehandlungen, wurden gesammelt. Die rekrutierten Freiwilligen wurden gebeten, ihren Mund 30 Sekunden vor der Entnahme der Wangenabstriche mit Leitungswasser zu spülen, um eine Kontamination durch Speisereste zu vermeiden. Bei jeder Person wurden beide Seiten der Wangenschleimhaut mit einem Wattestäbchen für 15 s abgewischt, und insgesamt fünf Proben wurden in 500 μl 10 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, 2 % SDS, enthaltend 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, gesammelt . Die Isolierung von DNA aus Wattestäbchen wurde durchgeführt.
Hier ist ein Copy-Paste, Bindestriche sind von mir.
DNA-Extraktion:
Wangenabstriche:
-Proben wurden in 500 μl Lysepuffer [10 mM Tris (pH 8,0), 10 mM EDTA und 2,0 % SDS] und 50 μl 10 % SDS suspendiert, gefolgt von 5–10 μl 20 mg/ml Proteinase K
-Inkubation 1–3 h bei 56°C bis zur vollständigen Auflösung des Gewebes
- Die DNA wurde dann aus jeder Probe mit einem gleichen Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol-Lösung (25:24:1) extrahiert und vorsichtig gemischt, indem die Röhrchen 3 Minuten lang umgedreht wurden.
- Proben wurden dann zentrifugiert (Eppendorf 5415R; Hamburg, Deutschland) für 10 min mit 10.000 g (4°C),
-obere wässrige Schicht wurde in ein frisches, sterilisiertes Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
-RNase A (10 &mgr;l von 10 mg/ml; Fermentas, Thermo Scientific, Deutschland) wurde zugegeben, und die Lösung wurde bei 37°C für 30 min inkubiert.
– Gleiche Volumina Chloroform:Isoamylalkohol-Lösung wurden zugegeben und zentrifugiert (Eppendorf 5415R), wiederum mit 10.000 g (4°C) für 10 min.
– Die obere wässrige Schicht wurde in ein sterilisiertes Mikrozentrifugenröhrchen überführt und das doppelte Volumen an gekühltem Isopropanol (Merck, Whitehouse Station, NJ, USA) wurde zusammen mit einem Zehntel Volumen an 3 M Natriumacetat zugegeben und auf –20 gekühlt °C für 1 h zur Ausfällung.
-Nach 1 h wurde die Probe 10 min bei 10.000 g (4°C) zentrifugiert (Eppendorf 5415R).
– Nach dem Dekantieren des Überstands wurden 250 &mgr;l 70 % Ethanol (Merck) zugegeben und das Pellet wurde aufgelöst; die Mischung wurde 10 min bei 10.000 U/min zentrifugiert und der Überstand vorsichtig dekantiert.
-Das Pellet wurde unter laminarem Luftstrom luftgetrocknet und das getrocknete Pellet wurde in 50 μl nukleasefreiem Wasser oder 1 × 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,6 (TE), Puffer resuspendiert und bei –20 eingefroren °C oder bei −80 °C für die Lagerung.
Ich mache viel gDNA- und cfDNA-Extraktion! Was Ro Siv erklärt hat, ist eine ziemlich standardmäßige Methode zur Extraktion von Wangenabstrichen, jedoch müssen die pK-Inkubationszeiten nicht annähernd so lang sein. Der Goldstandard in der DNA-Extraktion sind Kits von QIAGEN. Speziell für Ihre Zwecke würde ich etwas wie das QIAamp DNA Mini Kit verwenden (Sie können die Handbuchprotokolle auf ihrer Website einsehen - https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5- 8033-394fa5d752ea&lang=en ) In der Praxis konnte ich 4 Proben ohne Automatisierung ihres Schleuderprotokolls in insgesamt etwa 1,5 Stunden durchführen.
Die PCR-Zeit hängt von Ihren Zyklusbedingungen ab und davon, wie lange Sie brauchen, um eine Reaktion einzurichten usw., und Gele hängen davon ab, wie genau Ihre Bands sein müssen. Ich denke, das Ganze lässt sich locker in 4-5 Stunden erledigen. Nach meiner Erfahrung dauert die Blutentnahme nur geringfügig länger, ist aber offensichtlich invasiver und weniger praktisch. Ich stimme zu, dass Bukkal der richtige Weg ist. Als Referenz verwenden wir Puritan Hydraflock-Tupfer, aber das liegt bei Ihnen.
MattDMo
Techtrix
Ro Siv
Techtrix