Alternativen zur PCR

Bearbeitet nach Klärung in Frage,

Beginnen wir mit den normalen Funktionen beider Enzyme. Helicasen trennen DNA-Stränge, während Polymerase DNA-Stränge synthetisiert , wie in der folgenden Abbildung gezeigt. (Bildquelle: Wikimedia Commons )

Sehen Sie sich diese Animation an, sie wird Ihre Zweifel an der Funktion ausräumen. RNA-Polymerase hat jedoch beide Aktivitäten.

In Zellen ist die Wirkung der Helikase erforderlich, um DNA-Stränge zu trennen. Danach kann nur noch Polymerase wirken. Während der PCR erfolgt die Trennung der Stränge durch Erhöhen der Temperatur. Dieser Vorgang wird DNA-Schmelzen genannt . Diese Temperatur ist im Allgemeinen sehr hoch, um$90^oC$Zu$100^oC$abhängig von Ihrer Reihenfolge. Bei dieser Temperatur funktionieren viele Proteine ​​nicht, daher benötigen Sie thermostabile Polymarase. Vor etwa 40 Jahren wurde ein solches Enzym bei Extremophilen entdeckt ( Chien et al. 1976 ). Jetzt ist es als Taq-Polymerase im Handel erhältlich . Diese Enzyme sind rekombinante Proteine ​​mit einigen Mutationen, die auch ihre Ausbeute und Stabilität erhöht haben ( Villbrandt et al. 1997 ).

Kommen wir nun zu Ihrer Hauptfrage ( die ich glaube, diesmal richtig verstanden zu haben ).

Das Konzept, nach dem Sie fragen, wurde bereits erfolgreich im RNA-Nachweis getestet. Forscher haben „ Isotherme reverse Transkription thermophile Helikase-abhängige Amplifikation “ verwendet ( Goldmeyer et al. 2007 ). Sie verwendeten nicht nur Helikase, sondern auch Reverse Transkriptase (weil sie RNA nachweisten). Das folgende Bild (entnommen aus dem Papier) zeigt die wichtigsten Schritte in diesem Prozess. Kreise zeigen DNA-Polymerase, Quadrate zeigen reverse Transkriptase und Dreiecke zeigen Helikase an.

Zitat aus der Zeitung (Aufzählungszeichen stammen von mir),

Pfeile zeigen spezifische Primer an, Kreise zeigen DNA-Polymerase an, Quadrate zeigen reverse Transkriptase an und Dreiecke zeigen Helikase an. Die Erststrang-cDNA wird zunächst durch eine reverse Transkriptase synthetisiert

• (Schritte 1 und 2). Die RNA-DNA-Hybride aus der reversen Transkription werden dann durch UvrD- Helicasen getrennt, wodurch einzelsträngige (ss) RNA- und DNA-Matrizen erzeugt werden
• (Schritte 3 und 4). Die ssRNA tritt in die nächste Runde der RT-Reaktion ein
• (Schritt 5-a) Erzeugen von mehr Erststrang-cDNA. Die ssDNA wurde durch die DNA-Polymerase in doppelsträngige DNA umgewandelt
• (Schritt 5-b) und gleichzeitig in der tHDA-Reaktion amplifiziert
• (Schritte 6 bis 9). Dieser Prozess wiederholt sich, um eine exponentielle Amplifikation der RNA-Zielsequenz zu erreichen.

Isotherme DNA-Amplifikationstechnologien wurden entwickelt. Sie benötigen keine thermischen Zyklen, um DNA-Fragmente mit dieser Methode zu amplifizieren.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17720718