Mögliche Gründe dafür, dass DNA gut eindringt

Ich bin gerade dabei, die Bibliothek für Illumina MI-Seq mit mtDNA vorzubereiten. Unter Verwendung von NEB Hotstart LongAmp Polymerase war ich in der Lage, bis zu 10 kb Amplicons von mtDNA zu erhalten. Als ich jedoch zu einer anderen DNA-Probe wechselte, bemerke ich keine Banden mehr im Gel. Das Seltsame ist, dass ich, wenn ich diese Proben fragmentiere (Diagenode Bioruptor Acoustic Shearer), fragmentierte Ausstriche erhalte, die denen ähneln, die ich von der Fragmentierung eines 10-kb-Amplifikats erwarte, obwohl diese im Schacht stecken. Daher weiß ich nicht, ob ein 10-kb-Amplikon in den Vertiefungen steckt und nicht wandert (da ich ähnliche Ergebnisse für die Fragmentierung der festgefahrenen Proben sehe) oder ob ich in den Vertiefungen genomische DNA sehe und keine Amplifikation stattgefunden hat . Beeinflusst der 260/230-Wert die PCR-Amplifikation in irgendeiner Weise? (Ich habe einen sehr hohen 260/230-Wert ~5 für die neue DNA-Probe, die ich verwende)

Welche Art von Gel (Agarose, Acrylamid) und wie viel Prozent verwenden Sie?
Ich verwende 1% Agarosegel.
Ich weiß nicht genug über Ihre Gele, um zu wissen, was Ihre Bands haften lässt, aber ich habe gesehen, dass Bands in der Vertiefung bleiben, wenn DNA an bestimmte Proteine ​​und Peptide gebunden wird, aber ich mache es absichtlich. Könnte etwas an Ihre DNA gebunden sein? Könnte die DNA in Ihren Vertiefungen größer sein, als Sie annehmen, aber Fragmente unter Beschallung, um klein genug Fragmente zu machen?
Ich habe unten einige mögliche Lösungen/Fehlerbehebungen vorgeschlagen, aber @user137 wirft sehr interessante Punkte auf, die dringend berücksichtigt werden sollten! Ich habe eine mögliche Lösung bereitgestellt, um diesen Punkt möglicherweise anzugehen, einschließlich des Problems der DNA-Größe.

Antworten (3)

Dafür gibt es einen einfachen Grund: Ihr Agarosegel ist höchstwahrscheinlich zu dicht. Je nach Art der Agarose würde ich maximal ein 0,5-0,6%iges Gel herstellen.

Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Synbio gibt diese Liste für "Standard"-Agarose an, was ziemlich gut zu meinen Erfahrungen passt. Wenn Sie niedrig schmelzende Agarose verwenden, sieht diese Tabelle etwas anders aus, da die Gelmatrix nicht dicht ist. Der Nachteil ist, dass das Gel bei der Handhabung viel anfälliger für Beschädigungen ist.

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Ich habe die Bande bei 10 kb erhalten, die zuvor dem molekularen Marker von 10 kb entsprach. Ich bin mir also nicht sicher, ob die Dichte des Gels hier das Problem ist. Auch wenn die Probe feststeckt, läuft die Molekularmarkerleiter einwandfrei.
Das Problem ist, dass dies wirklich von der Agarose abhängt (und es gibt eine Vielzahl verschiedener Marken). Ich würde sagen, Sie befinden sich in einer Region, in der es schwierig wird, eine gute Lösung zu finden. Wenn Ihre Fragmente etwas größer werden, bleiben sie hängen und Sie erhalten etwas, wenn Sie sie fragmentieren. Ich würde ein weniger prozentiges Gel ausprobieren und sehen, wie das aussieht. Idealerweise mit der gleichen Probe, die Ihnen Probleme bereitet hat.
@AnuragMishra sei vernünftig. Sie müssen ein weniger sinnvolles Gel einer anderen Marke ausprobieren, bevor Sie davon ausgehen, dass seine Lösung falsch ist
Chris hat aus einem bestimmten Grund 9.000 Punkte
@caseyr547 Das bedeutet nicht, dass ich immer Recht habe.
@Chris ja, aber ich habe immer recht und ich stimme dir zu lol jk
Da das OP das Verhalten von Markern in diesem Gel kennt, scheint es unwahrscheinlich, dass dies das Problem ist. Auch wenn 1 % Agarose möglicherweise nicht geeignet ist, um eine gute Auflösung im 10-kb-Bereich zu erreichen, unterscheidet sich dies stark von einem Fragment, das nicht in das Gel eintritt. Ich würde versuchen, die Vorlage weiter zu bereinigen.
Dies ist schwer zu beurteilen, ohne ein Gelbild zu sehen. Wenn die Bibliotheksvorbereitung nicht gut verlief, könnte die DNA größer sein.
Ich denke, dies ist ein Fall, in dem Occams Rasiermesser angewendet werden kann. Das Problem trat bei einer neuen DNA-Probe auf, also muss diese Probe der Hauptverdächtige sein.
Das ist richtig. Ich würde es mit einem Gel mit niedrigerem Prozentsatz laufen lassen, um zu sehen, was passiert. Wenn es dann immer noch nicht funktioniert, ist es wahrscheinlich besser, frische DNA zu präparieren und aufzuhören, ein totes Pferd zu reiten.

Nachdem Sie Ihr Gel überprüft haben, sollten Sie die Primer, die Vorbereitung, die Qualität des XNA selbst, dann die richtigen Elektrophoreseniveaus und andere mechanische Fehler überprüfen. Ich würde denken, dass ein falscher Widerstand der Elektrophoreseverkabelung Ihr Problem verursachen würde.

Erstens, wie Sie erwähnt haben, was ich für das Wichtigste halte, ist, dass Sie klären müssen, welche DNA-Probe Sie im Gel beobachten. Das Beste, was Sie tun können, um sicherzustellen, dass Sie nur PCR-generierte DNA-Proben haben, ist, wenn Ihre PCR vorbei ist, Ihre DNA-Mischung mit dem Dpn I-Enzym zu behandeln, das methylierte DNA schneidet, die im Wesentlichen zelluläre DNA ist, wenn sie in Zellen methyliert wird und es sollte keine Auswirkungen auf Ihre PCR-generierte DNA haben, da sie nicht methyliert wird. Weitere Anweisungen zur Verwendung von Dpn I finden Sie auf Seite 7 und Seite 12 dieses Dokuments ( http://www.chem.agilent.com/library/usermanuals/Public/210518.pdf ). Sie können Ihre PCR-generierte DNA anschließend mit einem beliebigen Kit wie dem QIAquick-Gelextraktionskit (QAGEN) reinigen und isolieren, indem Sie im Wesentlichen dieses Protokoll verwenden, aber Sie verwenden keine Gele (http://sites.bio.indiana.edu/~chenlab/protocol_files/agarose_gel_extraction.pdf ). Sie können andere Kits verwenden, aber das hat immer für mich funktioniert! (Bitte beachten Sie, dass ich hier keine Kits bewerbe!!) Wenn Sie nun Amplifikate aus Ihrer PCR haben, sollten Sie in der Lage sein, sie im Nanodrop-Verfahren zu verwenden (unter Verwendung des 260/230-Verhältnisses als Richtschnur) und einen angemessenen Wert für Ihre zu erhalten Amplikon-Konzentration.

Wenn Sie zu diesem Zeitpunkt noch Ihre PCR-DNA haben, wie von Nanodrop angezeigt, und vielleicht ergibt ein Testverdau immer noch die erwarteten Banden, dann liegt das Problem am laufenden Prozess und höchstwahrscheinlich an Ihrem Gel, was ich als erstes vermutete. Wenn nicht, dann haben Sie keine Amplikons und versuchen einfach, Ihre ursprüngliche DNA laufen zu lassen.

Obwohl ich noch nie mit sehr großen zellulären DNA-Molekülen gearbeitet habe (ich arbeite mit Plasmiden), wurde ich jedoch darauf trainiert, sehr große DNA (in Agarosegel) bei sehr niedriger Spannung wie 10-50 V über Nacht in einem Kühlraum zu verarbeiten, da groß zelluläre DNA neigt nicht dazu, sehr gut in Gelen zu laufen, obwohl dies hauptsächlich für chromosomale DNA gilt, aber 10 kb ist immer noch ziemlich groß. Ich habe zuvor Plasmid-DNA von 12 kb in Gelen bei höheren Spannungen laufen lassen, aber niedrige Spannung ist am besten und vermeidet das Zerreißen und Scheren der DNA!

Mögliche Gründe dafür, dass DNA gut eindringt
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