In der Gelelektrophorese zeigen sich keine Banden, nicht einmal Marker

Woran ich schnell denken kann, ist, dass Sie das Gel falsch ausgeführt haben: Anstatt von - nach + Richtung haben Sie es umgekehrt ausgeführt und Ihre DNA ist aus dem Gel gegangen. Eine andere Sache könnte sein, dass das UV-Licht nicht eingeschaltet wurde oder defekt ist.

Hier sind meine 0,02 $ bei der Fehlerbehebung:

Ich sehe Gelspuren, wenn ich das Gel aus dem Gerät nehme,

Gut, Sie laden Ihr Gel richtig und die Dichte ist korrekt, sodass die DNA am Boden der Vertiefungen sitzt.

aber wenn ich sie fotografieren gehe: es zeigt sich nichts.

Dies weist auf ein Problem mit der Bilderzeugung hin: nicht genug EtBr, nicht genug DNA, durchgebrannte UV-Lampe, falscher UV-Filter oder falsche Einstellungen der Bildgebungsstation.

Ich habe die Proben nur 30-40 Minuten „laufen“ lassen (bei einer Stunde liefen die Bänder fast vom Gel ab).

Sie haben die Elektrophorese in der richtigen Richtung und nicht lange genug durchgeführt, um die Banden vollständig aus dem Gel zu entfernen.

Versucht mit verschiedenen Markern: kein Glück.

Laden Sie genug DNA mit diesen Markern?

Erneut etwas mehr EtBr hinzugefügt, um das Gel besser zu färben: kein Glück.

Ich vermute ein Problem mit dem Geldokumentationssystem.

Ich lasse auch das Licht in der Dunkelkammer aus, also glaube ich nicht, dass ich den Film früh dem Licht aussetze (Fehler sind jedoch immer noch möglich). Nehme ich den Film zu früh heraus?

Ich weiß nicht, wovon du hier sprichst. EtBr ist ein fluoreszierender Farbstoff unter UV-Beleuchtung und erfordert normalerweise keinen fotografischen Film. Einige Systeme nehmen ein Bild des Gels mit einer "Polaroid"-Kamera auf, aber das funktioniert, weil das Gel UV-Licht ausgesetzt und das einfallende Licht entsprechend gefiltert wurde. Die meisten Systeme verwenden jedoch ein Geldokumentationssystem mit einem durchleuchtenden Tablett und einem Digitalkamerasystem, um ein Bild aufzunehmen.

Einige Dinge zum Ausprobieren:

1) Bereiten Sie zwei Proben vor: eine Standardmarkerspur und eine DNA-Spur mit bekannter Konzentration (laden Sie viel DNA auf, z. B. 1-2 ug Plasmid, um zu wissen, dass Sie die Bande nicht übersehen können). Fügen Sie 1 ul EtBr-Stamm zu jeder Probe jeder Spur hinzu, mischen Sie und laden Sie dann das Gel auf. Lassen Sie das Gel mit Ihren üblichen Parametern laufen, behalten Sie die wandernde Farbstofffront im Auge und stellen Sie sicher, dass Sie die DNA nicht aus dem Gel laufen lassen. Dadurch wird sichergestellt, dass Sie zwei gute Proben haben, die auf dem Gel erscheinen sollten, und dass sie durch überschüssiges EtBr hell genug sind.

2) Bilden Sie das Gel ab. Dinge, die Sie hier überprüfen sollten:

• Stimmt die Emissionswellenlänge? EtBr erfordert eine kurz- oder mittelwellige UV-Beleuchtung (250-300 nm), aber einige Systeme verfügen auch über eine langwellige Beleuchtung. Langwelle funktioniert nicht.

• Ist die Filtereinstellung richtig? EtBr fluoresziert mit einem roten Peak (max. 595 nm), und wenn ein Filter vorhanden ist, um diese Bande zu entfernen, werden Sie auch nichts sehen. Normalerweise gibt es keinen Filter oder eine „EtBr/UV“-Filteroption. Hier ist ein technisches Dokument mit einem Beispiel für die Einrichtung der EtBr-Erfassung.

• Ist die Kamera auf eine angemessene Verschlusszeit/Belichtungszeit eingestellt? Versuchen Sie, mit 20 ms bis 200 ms zu experimentieren. Auf unserem System sind 40 ms ideal. Eine zu kurze Belichtungszeit bedeutet, dass Sie nichts sehen.

• Ist die Blende der Kamera maximal geöffnet? Wenn die Iris zu weit geschlossen ist, schränkt sie das einfallende Licht für die Bilderzeugung ein und es entsteht entweder kein Bild oder ein schwaches Bild. Dies wirkt sich auch auf die ideale Belichtungszeit aus (siehe oben).

• Ist die Kamera fokussiert und betriebsbereit? Können Sie sich ein Objekt wie Ihre behandschuhte Hand oder das physische Gel vorstellen, bevor Sie die EtBr-Einstellungen korrekt vornehmen?

Möglicherweise wird Ihr interessierendes Gen nicht perfekt geklont. Stellen Sie aus diesem Grund sicher, dass Sie zuerst pcr entsprechend Ihrer Sequenz ausführen und dann das Gel ausführen müssen