PCR funktioniert nicht

Ich versuche, die Integration von DNA in eine ganz bestimmte Region des E. coli-Genoms zu überprüfen, und vergleiche dazu mittels 2,5% Agarose-Gelelektrophorese die Länge von Ganzzell-PCR-Produkten (ich erwarte 120 und 242 bp Bänder).
Leider waren die letzten 3 PCRs sehr erfolglos, oder sollte ich sagen nicht interpretierbar, da nur die nicht verbrauchten Primer sichtbar waren (+ gDNA) und keine 120 bp Amplikons.

Gelelektrophorese VORHER
Diese Banden sind 120-bp-Amplikons – Q5. Gelelektrophorese NACHIch würde diesen ohnmächtigen Bands nicht trauen - Taq.

Die Leiter, die ich verwendet habe, ist 2-Log 0,1-10 kb.

Hier ist auch das Rezept für eine 25-ul-Reaktion:
- 5 ul Polymerasepuffer 5X
- 0,5 dNTPs 10 mM
- 0,25 ul von jedem Primer 50 uM
- 0,25 ul Polymerase (ich habe Q5, Taq und Phusion ausprobiert)
- 1 ul Vorlage (Bakterien)
- 17,75 ul H20

Was könnte schief gelaufen sein? Interpretiere ich die Ergebnisse falsch? Füge ich zu viel Template-DNA hinzu? Ist es möglich, dass sich die Primer nach mehrmaligem Einfrieren zersetzen? Gibt es zu viele Inhibitoren in Bakterien?

Antworten (3)

Zuerst sollten Sie überprüfen, ob Ihre Annealing-Temperatur für die Schmelztemperatur Ihrer Primer geeignet ist. (und dass die anderen PCR-Parameter wie die Verlängerungstemperatur für Ihre Polymerase geeignet sind)

Zweitens, obwohl die meisten Leute Ihnen sagen werden, dass es nicht notwendig ist, habe ich festgestellt, dass es hilfreich sein kann, die Template-DNA nur ein wenig zu bereinigen. Für Bakterien würde ich 5-10 Minuten lang in Wasser kochen (eine Kolonie in 20-30 ul geben), die Zelltrümmer abzentrifugieren und 0,5 ul des Überstands nehmen.

Hast du eine Positivkontrolle? (versuchen Sie, eine andere Region des Genoms zu amplifizieren, die Sie nicht modifiziert haben)

Von Ihren anderen Vorschlägen würde ich sagen, dass ein Primerabbau unglaublich unwahrscheinlich ist.

Niemand kann Ihnen genau sagen, was schief gelaufen ist, ich würde überprüfen, ob Ihre Primer die richtige Sequenz haben. Sie können sie erneut oder leicht anders anordnen; Grundierungen sind billig und kommen schnell.

MgCl2 kann auch der Grund sein. Ich habe Titer von MgCl2 1,5, 2, 2, 5, 3 mit allen anderen Bedingungen ausprobiert und es hat funktioniert

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