Ich vergleiche die miRNA-Expressionsniveaus in 3 verschiedenen Gruppen, aber ich habe wenig Geld und Zeit. Ich muss einige vorläufige Ergebnisse erhalten, um die eigentliche Forschung in Gang zu bringen, also habe ich beschlossen, meine Proben zu bündeln und die Ergebnisse für 372 miRNAs zu erhalten, und wenn dann eine von ihnen eine deutliche unterschiedliche Expression zeigt, werde ich die Expressionsniveaus dieser Kandidaten-miRNAs in größerem Umfang untersuchen Gruppen. Aber ich kann mich nicht entscheiden, wie ich meine Proben für das Pooling gruppieren soll. Soll ich 3 einzelne Proben für jede der 3 Gruppen (insgesamt 9 Proben) auswählen oder sollte ich die Gesamt-RNA für jede Probe für jede Gruppe extrahieren, 3 RNA-Pools erstellen und dann nur dreifach für jeden Pool durchführen? Die Zeit und das Geld, die in beiden Situationen aufgewendet werden, werden gleich sein. Ich denke, die zweite Methode ist angemessener, aber ich befürchte, dass sie einige deflationierte p-Werte erzeugen könnte, was zu einer falschen Entdeckung führt.
Soll ich 3 einzelne Proben für jede der 3 Gruppen (insgesamt 9 Proben) auswählen oder sollte ich die Gesamt-RNA für jede Probe für jede Gruppe extrahieren, 3 RNA-Pools erstellen und dann nur dreifach für jeden Pool durchführen?
Hängt von der Art Ihrer Proben ab. Im Allgemeinen würde das Pooling die Expression verschiedener Individuen mitteln. Das Pooling wird im Allgemeinen durchgeführt, wenn Sie eine geringe RNA-Ausbeute pro Einzelprobe haben. Wenn dies nicht der Fall ist, sollten Sie mehrere Personen pro Gruppe untersuchen (drei sollten in Ordnung sein; mehr ist besser). Dies wird Sie über die Variation zwischen Individuen/Proben innerhalb einer Gruppe informieren. Sie können wiederum drei technische Replikationen für die qPCR einrichten, um die technische Variation zu messen. Insgesamt hätten Sie also 27 PCR-Reaktionen. Dies wäre nicht sehr kostspielig (es sei denn, Sie verwenden einen TaqMan- ähnlichen Assay. Selbst wenn Sie manchmal mit einer größeren Anzahl von Proben arbeiten, können Sie die pro Probe verwendete Menge an Reagenz sparen.