Optogenetik - Wie wirken mikrobielle Opsine?

Die Verwendung von Rhodopsin ist nichts Besonderes im Vergleich dazu, eine Zelle dazu zu bringen, irgendein Transgen zu exprimieren. Diese Frage kann dann gelesen werden als:

Wie läuft der Prozess ab, bei dem eine Zellpopulation zielgerichtet und mit einem interessierenden Gen implantiert wird?

Es gibt viele Möglichkeiten, die vom spezifischen Zelltyp abhängen und davon, ob Sie dies in vitro , in vivo und in welcher Spezies tun möchten, und es wäre sehr komplex, sie alle hier im Detail zu erklären, daher beschränke ich mich darauf zwei Ansätze, die bei der Optogenetik bei Nagetieren beliebt sind: Virusinfektion und Transgenese.

Bei einer Virusinfektion wird ein inaktiviertes Virus verwendet, um das Transgen zu übertragen. Im Wesentlichen konstruiert man ein DNA-Stück mit dem Gen für das interessierende bakterielle Opsin und steckt es in eine virale Hülle , das ist eine Reihe von Proteinen, die den „Körper“ des Virus bilden und sein genetisches Material enthalten.
Anschließend injizieren Sie das Virus in die gewünschte Zone (z. B. in einen bestimmten Hirnkern) und warten darauf, dass es die Zellen um die Injektionsstelle herum infiziert. Eine Woche später exprimieren diese Zellen das Transgen.

Aus (zumindest denke ich) historischen Gründen waren die ersten Virentypen, die für diesen Ansatz verwendet wurden, Lentiviren. Diese sind jedoch etwas komplexer zu handhaben (insbesondere, da sie spezielle Räume erfordern, in denen sie sicher gehandhabt werden können), sodass Adeno-assoziierte Viren (AAV) immer beliebter werden.

Beachten Sie, dass das Virus inaktiviert ist, das heißt, es kann sich nicht replizieren, sondern nur die Zellen um die Infektionsstelle herum infizieren, sich aber nicht ausbreiten. Dies geschieht sowohl aus Sicherheitsgründen als auch, weil Sie möchten, dass die Infektion auf die bestimmte Region beschränkt wird, in die Sie das Virus injiziert haben.

Wie ich bereits sagte, können Sie anstelle eines bakteriellen Opsins ein beliebiges Gen von Interesse einsetzen, das Verfahren ist das gleiche. Was die Opsine betrifft, waren die ersten beiden, die verwendet wurden, das Kanalrhodopsin-2 ( ChR2 ), ein Kanal, der für blaues Licht empfindlich ist und der verwendet werden kann, um die Zellen zu depolarisieren (= zu erregen), und das Halorhodopsin ( NpHR ), eine Chloridpumpe, die empfindlich ist zu gelbem Licht, das wiederum die Zellen hyperpolarisiert (= hemmt).
Heutzutage gibt es Dutzende von Varianten dieser und anderer Opsine, die verwendet werden können, um die Zellaktivität mit Licht anzutreiben. Viele davon werden in dieser (Vorsicht! ziemlich technischen) Rezension beschrieben:

Optogenetik in neuronalen Systemen - Yizhar et al., Neuron 2011

Die Transgenese funktioniert stattdessen, indem sie ein Tier erzeugt, das das Opsin (oder irgendein anderes Gen) in seiner DNA trägt. Dies kann auf verschiedene Weise erfolgen, beispielsweise durch Mikroinjektion embryonaler Stammzellen, die das Transgen tragen.

Eine ziemlich detaillierte Erklärung des Prozesses finden Sie hier: Transgene Zellen und Gen-Knock-outs , gut zusammengefasst durch diese Abbildung (aufgenommen von derselben Seite):

Generation transgener Mäuse http://9e.devbio.com/images/ch02/wt020302-2.jpg

Aber wie erhält man Zelltypselektivität ?
Vor das Gen für das Opsin müssen Sie auch eine andere Sequenz setzen, die als Promotor bezeichnet wird. Der Promotor ist eine Sequenz, die für jedes Gen spezifisch ist und die verwendet wird, um zu bestimmen, welche Gene eine Zelle transkribieren wird oder nicht. Beispielsweise wird der Promotor für das Gen, das für ein Protein kodiert, das nur in Muskeln vorhanden ist, von Muskelzellen verwendet, nicht aber von Neuronen. Sie können sogar spezifischer werden, indem Sie beispielsweise Promotoren verwenden, die für eine Untergruppe von Zellen typisch sind und nicht für andere (z. B. verwenden glutamaterge Neuronen eine andere Gruppe von Promotoren als GABAerge Neuronen, obwohl sich diese beiden Gruppen – zumindest teilweise – überlappen). . Dies bedeutet jedoch, dass Sie den verwendeten DNA-Vektor ändern müssen, wenn Sie den Zelltyp ändern möchten, an dem Sie arbeiten.
Ein häufig verwendeter Ansatz, um dies zu vermeiden, ist die Verwendung von Cre-abhängigen Vektoren (beachten Sie, dass dies sowohl für Virusinfektionen als auch für transgene Tiere verwendet werden kann).
Im Wesentlichen haben Sie eine Mauslinie, die ein vom P1-Phagen abgeleitetes Protein namens Cre-Rekombinase nur in dem interessierenden Zelltyp exprimiert (wieder unter Verwendung eines spezifischen Promotors). Cre hat die Eigenschaft, DNA neben bestimmten 34 Basenpaare langen Sequenzen namens loxP (mit Sequenz ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT) zu schneiden. Wenn Sie eine loxP-[some sequence in the middle]-loxPCre-Rekombinase haben, schneidet sie im Wesentlichen die Sequenz in der Mitte weg und hinterlässt nur eine loxP-Sequenz.
Heutzutage sind Hunderte verschiedener Cre-exprimierender Mauslinien im Handel erhältlich, um viele verschiedene Zelltypen in verschiedenen Organen anzugreifen.

Jetzt brauchen Sie nur noch ein Konstrukt, mit dem Sie das Opsin Cre-abhängig ausdrücken können. Dies wurde von der Gruppe von Hongkui Zeng getan und in diesem Artikel beschrieben:
Eine Toolbox von Cre-abhängigen optogenetischen transgenen Mäusen für lichtinduzierte Aktivierung und Stummschaltung. -Madisen et al., Nat. Neurosci. 2012

Ohne zu sehr ins Detail zu gehen, besteht die Idee darin, eine STOP-Sequenz mit zwei loxP-Stellen zu flankieren. Dadurch wird die Transkription blockiert (was eine STOP-Sequenz tut), es sei denn, Cre-Rekombinase ist vorhanden.

Im Wesentlichen:

Quelle : ich selbst, CC-by-sa lizenziert , darf gerne wiederverwendet werden

Beachten Sie, dass ROSA26 in dem Schema ein allgegenwärtiger Promotor ist, d. h. ein Promotor, der von allen Zellen verwendet wird, sodass in diesem Fall die Spezifität durch die Expression von Cre-Rekombinase und nicht durch den Promotor dieses Konstrukts gegeben ist. Außerdem wird ein fluoreszierender Reporter (z. B. GFP ) eingefügt, um visualisieren zu können, wo das Opsin exprimiert wird.

Indem Sie diese Mäuse mit der/den Cre-Linie(n) Ihrer Wahl züchten, können Sie dann die Opsine in dem Zelltyp Ihres Interesses exprimieren.