Das pET-Plasmid wird zur Proteinexpression mit T7-Promotor in Expressionsstämmen wie E.coli BL21(DE3) verwendet.
Es enthält ein lacI-Gen, das für das lac-Repressorprotein codiert, ein interessierendes Protein unter der Kontrolle eines T7-Promotors für die T7-RNA-Polymerase und einen lac-Operator, der die Transkription blockieren kann, direkt hinter dem Promotor. Das lac-Operon ist eine weitere Kontrolle der Transkription des interessierenden Proteins.
Darüber hinaus befindet sich die T7-Polymerase ebenfalls im Genom unter der Kontrolle des lac-Operons.
Wenn IPTG hinzugefügt wird, wird der lac-Repressor inaktiviert -> T7-Polymerase und daher wird das interessierende Protein exprimiert.
Das Lac I-Gen ist bereits im Genom des verwendeten Expressionsstammes vorhanden, warum wird es auch in die pET-Vektoren kloniert?
Gemäß diesem Artikel führt eine einzelne lacI -Genkopie zu etwa 10 Kopien des lacI-Proteins pro Zelle, und wir können daraus schließen, dass dies die Menge ist, die erforderlich ist, um ein einzelnes lac - Operon reprimiert zu halten. Der Artikel erwähnt auch die lacI Q - Mutation im Promotor von lacI , die zu einer zehnfachen Erhöhung des lacI-Proteinspiegels führt.
Wenn ein lac -Expressionskonstrukt mit mehr als 100 Kopien pro Zelle vorhanden ist, wird das Ergebnis eine Leaky-Repression sein, und dies kann zu einer Selektion auf Mutationen im interessierenden Gen führen, wenn es schädliche Wirkungen auf die Wirtsbakterien hat. Der einfachste Weg, dieses Problem zu umgehen, besteht darin, ein lacI- (oder lacI Q )-Gen auf das Expressionsplasmid zu setzen, so dass die Repressorspiegel der Kopienzahl des lac -Operators entsprechen, wie in den pET-Vektoren.
Chris
jan-glx
Chris
Chris