Was ist der beste Weg, um zwei Proteine ​​in einer Säugetierzelle zu exprimieren?

Ich habe zwei Proteine ​​und werde einen Vektor mit beiden Genen für eine stabile Transfektion vorbereiten. Jedes Protein wird seinen eigenen Promotor haben und ich werde den PiggyBac-Vektor verwenden, um eine einzelne Kassette mit beiden Genen darin in die Chromosomen einzufügen. Meine Fragen sind:

  1. Wenn ich für beide Gene denselben Promotor (CMV, SV40 oder einen induzierbaren) verwende, wie würde sich dies auf die Expressionsniveaus auswirken? Ich habe in einigen Artikeln gelesen, dass eines der Gene möglicherweise niedriger exprimiert wird als das andere. Wenn Sie Erfahrungen aus erster Hand haben, bin ich Ihnen dankbar, wenn Sie sie teilen.
  2. Wenn ich für beide den gleichen Promotor verwende, sie aber weit entfernt platziere (dh an den Enden der Kassette), würden die Expressionsniveaus erneut beeinträchtigt werden? Es klingt einfach genug, aber ich denke, die Leute hätten etwas veröffentlicht, wenn sie damit ein gutes Ergebnis erzielt hätten.
  3. Wenn ich verschiedene Promotoren für jedes Gen verwende (z. B. CMV für das eine und Tet-induzierbar für das andere), wie würde es funktionieren? Ich konnte kein Papier finden, in dem dies verwendet wurde, und ich möchte mit diesem Ansatz fortfahren. Wenn Sie also Erfahrungen haben, bin ich für jede Hilfe sehr dankbar.

Ich möchte weder IRES noch 2A-Peptid verwenden. Ich möchte dieses Experiment in der Transkriptionsphase kontrollieren können.

Antworten (2)

Sie können einen bidirektionalen Promoter verwenden. Das von Ihnen erwähnte Problem mit Proteinen, die nicht auf derselben Ebene exprimiert werden, tritt aufgrund der Konkurrenz um Polymerase auf. Aber es gibt gut optimierte Teile und auch im Handel erhältliche Vektoren, die gut funktionieren.

Sie können Gene in einer seriellen Reihenfolge klonen. Es wird kein Problem sein. Lassen Sie einfach einen 100-bp-Linker nach dem polyA-Signal des vorherigen Gens. Wenn Ihre Kassette zu groß wird, wird das Einsetzen etwas schwierig. Deshalb verwenden die Leute IRES oder TA-Peptide usw.

Auf Retroviren basierende Einfügungen funktionieren ziemlich anständig, aber Sie können die Variation der Kopienzahl zwischen verschiedenen Zellen nicht kontrollieren.

Sie können zwei verschiedene Promotoren verwenden. Die Dynamik wird von der Stärke des Promotors und der Konzentration des Induktors abhängen.

Danke für deine Antwort. Ich habe mir auch die bidirektionalen Promotoren angesehen, aber beschlossen, zwei verschiedene Promotoren auszuprobieren. Ich wollte wirklich nicht mit IRES oder 2A gehen, weil ich zu viel Angst habe, in die Interaktion einzugreifen, riskiere es besser nicht :). Ich werde das Experiment in Kürze starten und meine Erfahrungen hier teilen, wenn ich einige Ergebnisse erhalte.

Ich ging meine Fragen durch und stellte fest, dass dies immer noch unbeantwortet ist. Nun, ich habe jetzt die Antwort.

Ich entwarf das Konstrukt mit zwei getrennten Promotoren (CMV für den einen und Tet-induzierbar für den anderen) und erzielte wirklich gute Ergebnisse. Ich hatte keine Schwierigkeiten, die Proteine ​​zu exprimieren. Ich konnte das Tet-induzierbare Protein sehr gut kontrollieren und bekam mit CMV konstante Spiegel des anderen Proteins.

Lange Rede, kurzer Sinn: Sie können zwei Gene sicher unter zwei separate Promotoren stellen, stabile Zelllinien damit herstellen und gute Expressionsniveaus erzielen.

Was ist der beste Weg, um zwei Proteine ​​in einer Säugetierzelle zu exprimieren?
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