Ist es möglich, die Cistrons eines polycistronischen Insertionsfragments in einem einzigen Plasmid zu exprimieren?

Ich habe ein Insertionsfragment, das ich von pUC19 in Escherichia coli exprimieren möchte. Das Insertionsfragment ist ein Unterabschnitt einer größeren Operonsequenz und enthält nur die letzten beiden Cistrons dieses Operons.

Ich plane, dieses Fragment unter der Kontrolle seines einzelnen lac-Promotors in pUC19 einzufügen. Daher gibt es zwei Cistrons unter der Kontrolle eines einzigen Promotors (was natürlich sehr ähnlich ist, wie er im WT-Operon exprimiert würde).

Meiner Meinung nach sollte die Expression beider Cistrons unter der Kontrolle des einzelnen pUC19-lac-Promotors die Translation beider Gene ermöglichen; Sobald die mRNA transkribiert ist, haben beide Cistrons ihre jeweiligen Ribosomenbindungsstellen stromaufwärts ihrer ORFs und sollten übersetzt werden.

Meine Frage ist, hat jemand jemals Erfahrung mit der Expression polycistronischer Fragmente aus Plasmiden unter Verwendung von nur einem einzigen Promotor für das gesamte Fragment? Theoretisch sehe ich keine offensichtlichen Probleme damit, aber ich dachte, ich würde fragen, bevor ich fortfahre. Letztendlich würde ich lieber beide Cistrons von einem einzigen Plasmid exprimieren, als jedes Cistron auf einem separaten Plasmid zu exprimieren.

Prost! Izaak

Antworten (1)

Wenn ich das richtig verstehe, suchen Sie nach einer Option für den polycistronischen Ausdruck. Haben Sie die Verwendung von T2A- oder P2A-Sequenzen in Betracht gezogen? Diese stammen vom Virus und zerlegen das Polypeptid im Wesentlichen in zwei Teile, das sogenannte selbstspaltende Peptid T2A. Der eigentliche Mechanismus seiner Arbeit besteht darin, dass das Ribosom auf der Sequenz stehen bleibt und nicht in der Lage ist, eine Peptidbindung zu bilden, wodurch die Translation effektiv mit der nächsten nach der T2A-Aminosäure neu gestartet wird.

Natürlich verlieren Sie die unabhängige Kontrolle über die Expression, beide Produkte werden auf dem gleichen Niveau exprimiert (aber der Abbau kann unterschiedlich sein).

Sie sollten also erwägen, ein Konstrukt zu erstellen, das in etwa so aussieht:

lac :gene1-T2A-gene2-stop

Die Sache ist, dass a) es in E. coli möglicherweise nicht funktioniert und b) es möglicherweise nicht notwendig ist, da der Hauptzweck von T2A das gleiche Expressionsniveau von zwei Polypeptiden ist. Und wenn Ihre 2 Gene groß sind, ist es für Bakterien einfacher, mit zwei separaten Plasmiden umzugehen, als mit einem, aber viel größeren.

Aha, interessant! Ich weiß nicht, T2A ist jedoch notwendig; Die Gene selbst haben ihre natürlichen Transkriptionsterminationssequenzen, daher sollte das Ribosom in der Lage sein, das Ende jedes ORF zu „parsen“, der die Produkte trennt. Die Gene sind prokaryotisch, also denke ich, dass die Geburts-RBS der Operons funktionieren sollten. Ich wollte es hier nur überprüfen, um zu sehen, ob es irgendwelche großen No-Gos gibt.
Die Gene bilden zusammen ein Heterodimer, also ist ein gleichmäßiger Ausdruck das, was ich anstrebe ;) Prost auf die Hilfe. Ich wusste nichts über T2A, aber es ist nützlich zu wissen!
deine Vermutung scheint richtig zu sein. Ich habe mich nie mit der Expression mehrerer Gene beschäftigt, also idk. Da es jedoch ein Plasmid für das gibt, was Sie beschreiben, sollte es funktionieren: snapgene.com/resources/plasmid_files/…
nie mit der Expression mehrerer Gene in Bakterien beschäftigt
pETDuet ist nah dran, aber es ist nicht genau das, was ich tun möchte. pETDuet erfordert, dass ich das PCR-Fragment (das beide Gene enthält) aufspaltet, sodass jedes der beiden Gene unter einem der beiden Promotoren auf dem pETDuet-Plasmid exprimiert wird. Es gibt zwei Promotoren und zwei getrennte MCS in diesem Plasmid. Ich möchte Expression unter nur einem Promoter.
Ich denke jedoch, dass ich pETDuet bestellen kann, nur für den Fall, dass die Expression eines einzelnen Promotors von der pUC19-Expression nicht funktioniert ;) Prost auf den Hilfemann!
Ist es möglich, die Cistrons eines polycistronischen Insertionsfragments in einem einzigen Plasmid zu exprimieren?
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