Wo soll das Gen nach dem eukaryotischen Promotor platziert werden, um die besten Expressionsniveaus zu erreichen?

Soweit ich weiß, gibt es einen optimalen Abstand zwischen einem Promotor und dem Gen für die besten Expressionsniveaus. Wie groß ist diese Distanz für gängige Promoter wie CMV, SV40? Wenn Sie diesbezüglich Erfahrungen aus erster Hand haben (z. B. wenn Sie das Gen stromabwärts des Promotors geklont haben und keine Expression gesehen haben/gesehen haben) und diese teilen, bin ich Ihnen dankbar.

Wenn Sie umfassende Kenntnisse für andere Veranstalter haben, können Sie diese auch gerne in die Liste aufnehmen. sie müssen nicht üblich sein. Ich möchte nur die Erfahrungen der Leute zu diesem Thema hören.

ein 10bp-Linker ist ausreichend. Aus all Ihren anderen Beiträgen entnehme ich, dass Sie versuchen, ein synthetisches System aufzubauen. Meine persönliche Strategie für solche Dinge besteht darin, Sequenzen aus den Vektoren in Ihrem Labor zu entnehmen, von denen Sie wissen, dass sie recht gut funktionieren.
Eukaryoten sind ziemlich allgemein - verschiedene Eukaryoten haben sehr unterschiedliche Regulationssysteme. Reden Sie von so etwas wie Mensch oder so etwas wie Hefe?
Sehen Sie sich die Sequenzen für einige gängige/beliebte Vektoren für Ihren Zielorganismus an. Wie WYSIWYG betonte, muss es nicht sehr groß sein und kann etwas variieren, je nachdem, wo Sie Ihr interessierendes Gen in die multiple Klonierungsstelle einfügen.
Vielen Dank für Ihre Kommentare. Ich habe nach anderen üblichen Konstrukten gesucht und mich entschieden, etwa 40 bp zwischen dem Promotor und dem Initiationscodon zu lassen (dies war der minimale Abstand, den ich aufgrund der Beschränkung der Restriktionsstelle lassen konnte). @Bitwise, ich verwende Säugetierzellen (insbesondere Fibroblasten- und MDCK-Zellen).

Antworten (1)

Ich habe pEYFP-N1 (Stammvektor) verwendet, bei dem der Abstand zwischen dem CMV-Promotor und dem EYFP-Startcodon ~88 nt beträgt und die Expression hoch ist.

Ich klonierte auch ein Protein 5' des EYFP, nur 4 nt nach dem CMV-Promotor. Der Ausdruck dieser Verschmelzung war ebenfalls hoch. Da ich das chimäre Protein nur in Experimenten verwendet habe, habe ich nicht versucht, Unterschiede in der EYFP-Expression zu beurteilen.

Wenn Sie hier nachsehen: https://synbiota.com/projects/19/sequences sehen Sie den grundlegenden pEYFP-N1-Vektor und die Trennung zwischen dem CMV-Promotor und der EYFP-kodierenden Sequenz.

Auf Wiki: "Das TATA-Element und BRE befinden sich typischerweise in der Nähe der Transkriptionsstartstelle (typischerweise innerhalb von 30 bis 40 Basenpaaren)."

Wo soll das Gen nach dem eukaryotischen Promotor platziert werden, um die besten Expressionsniveaus zu erreichen?
AntwortenHierDatenschutz-Bestimmungen1y, 0v