Mir ist aufgefallen, dass sich das native Molekulargewicht eines Enzyms vom Molekulargewicht seiner Untereinheit unterscheidet. Warum sind sie anders? Sind die Gene, die zur Expression des Enzyms benötigt werden, im nativen Organismus und im heterologen Expressionssystem nicht dieselben?
Beeinflusst das heterologe Expressionssystem zufällig das Molekulargewicht des endgültigen Enzymprodukts? Wenn das so ist, wie?
Ihre Frage wird in der Arbeit beantwortet, das Protein existiert wahrscheinlich als Homodimer in vivo und Denaturierung (wie sie beispielsweise mit SDS PAGE -> Western Blot durchgeführt wird) trennt die Dimere in Monomere:
„Um die Quartärstruktur zu bestimmen, wurde eine Größenausschluss-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung eines Agilent Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographiesystems der Serie 1100 mit einer Bio-Sil SEC-250-Säule (300 x 7,8 mm) und einer mobilen Phase von 0,1 M Na2PO4 durchgeführt , 0,15 M NaCl und 0,01 M NaN3, pH 6,8.Ein Bio-Rad-Standard wurde verwendet, um die Retentionszeit der Säule in Bezugauf die Molekülmasse zu standardisieren (ergänzende Daten).Alle Experimente wurden zweimal mit <0,05 min Abweichung in der Retention wiederholt Die Molekülmasse von XR wurde aus seiner Retentionszeit zu etwa 53 kDa berechnet.Die Monomerisierung konnte in Gegenwart von 15 % SDS induziert werden, was dazu führte,dass XR als einzelner Peak eluierte, mit einer Retentionszeit, die einer Molekülmassevon entsprach ~34 kDa Die Daten legen nahe, dass das native XR ein nicht kovalent gebundenes Dimer ist.Der signifikante Unterschied zwischen dem berechneten Molekulargewicht des Dimers und seinem scheinbaren Molekulargewicht ist nicht ungewöhnlich für XRs aus anderen Spezies (7, 21, 33), die ebenfalls typischerweise als Dimere vorliegen. Um sich jedoch über die Proteingröße zu vergewissern, wurde N. crassa XR einer Massenanalyse durch Elektrospray-Ionisations-Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie unterzogen. Der Peak mit der höchsten Häufigkeit hatte einen Wert von 38.381 m/z, was genau der vorhergesagten Molekülmasse für das mit His6-Tag versehene XR mit entferntem N-terminalem fMet entsprach (ergänzende Daten). Außerdem entspricht ein 2M+-Peak mit einer Häufigkeit von etwa 20 % bei 76.759 m/z gut der vorhergesagten Masse der dimeren Form des Enzyms (76.762 Da)."
Luigi
Chris
wswr