Ich versuche, GFP in S. cerevisiae unter Verwendung des GAL1-Promotors zu exprimieren.
Neben meiner induzierten Kultur (in SD-Medium auf Galactosebasis) züchte ich immer eine nicht induzierte Kultur (in SD-Medium auf Dextrosebasis). Ich sehe ungefähr den gleichen sehr niedrigen Fluoreszenzpegel in beiden Kulturen und auch eine Bande bei 27 kD auf einem PAGE-Gel. Es findet keine Überexpression des GFP statt, die Fluoreszenz ist für das Auge sehr schwach und die Kulturen sind im sichtbaren Licht nicht grün, wie E. coli-Kulturen, die GFP überexprimieren.
Auf dem PAGE-Gel scheint die Proteinmenge sowohl in den nichtinduzierten als auch in den induzierten Proben gleich zu sein. Ich muss das Protein überexprimieren, dieses undichte Expressionsniveau ist nicht akzeptabel. Wie gehe ich vor, um es zu beheben? Ich baue derzeit eine Kultur auf, um eine Plasmidpräparation durchzuführen, die zur Sequenzierung gesendet werden soll, um sicherzustellen, dass die Promotorregion des Plasmids intakt ist.
Es gibt ein paar Dinge, die hier seltsam sind. Erstens haben Sie eine geringe Expression in Gegenwart von Galactose. Der GAL1-Promotor ist wirklich stark, das kommt mir seltsam vor. Selbst wenn es undicht war, sollten induzierte und nicht induzierte Tag und Nacht sein. Sie sollten jedoch bedenken, dass Sie es möglicherweise immer noch nicht mit dem Auge sehen können. Zweitens ist es seltsam, dass es in Gegenwart von Glukose (oder in Ihrem Fall Dextrose) undicht wäre. Die Glukose soll den Promotor nicht nur an der Aktivierung hindern, sondern ihn sogar unterdrücken.
Ein paar mögliche Korrekturen, die mir in den Sinn kommen:
1) Überprüfen Sie Ihren Stamm-Genotyp. Einige Stämme haben kein gal4, den Transkriptionsaktivator des GAL1-Promotors. Wenn Sie dies also nicht haben, funktioniert das System in Ihrem Stamm nicht. Ebenso haben Sie möglicherweise kein intaktes UAS, wodurch die Unterdrückung fehlschlagen würde. Es können auch andere Probleme auftreten, die einen Stamm für dieses System ungeeignet machen.
2) Sequenzieren Sie Ihren Promotor/Gen. Es ist eine Art Schmerz, aber wenn Sie eine Mutation in Ihrem Gal1-Promotor haben, könnte dies der Grund für all Ihre Probleme sein. Überprüfen Sie auch die UAS, da dies zu Verdrängungsproblemen führen würde. Überprüfen Sie schließlich, ob das Gen selbst an der Stelle eingefügt ist, von der Sie glauben, dass es sein sollte. Wenn Sie ein Missgeschick bei der Rekombination haben, kann dies das Problem sein. Das Auftreten einer zusätzlichen Bande bei einem niedrigen Molekulargewicht lässt mich vermuten, dass dies ein Problem sein könnte.
3) Versuchen Sie in diesem Sinne, einen anderen Klon auszuwählen. Vielleicht hatten Sie Pech und die Kolonie, die Sie ausgewählt haben, hatte einen Defekt, und eine andere Kolonie wird das sein, was Sie denken.
4) Wenn Sie es noch nicht getan haben, machen Sie frische Vorräte Ihrer Galaktose- und Glukosemedien. Vielleicht haben Sie Verunreinigungen oder ein anderes Problem in Ihren Medien, und daher ist das, was Sie den Zellen zu geben glauben, nicht das, was Sie den Zellen geben.
Wie auch immer, das ist alles, was ich habe. Viel Glück!