Ich führe PCR-Reaktionen mit verschiedenen Sätzen von degenerierten Primern durch und möchte wissen, was in den Master-Mix aufgenommen werden sollte
Mein üblicher Mastermix:
Auf Eis gebe ich meine Forward- und Reverse-Primer in die entsprechenden PCR-Röhrchen, füge Master-Mix zu jedem PCR-Röhrchen hinzu, dann füge ich kurz bevor ich sie in den Thermocycler stecke, Taq hinzu und mische.
Ist dies eine angemessene Vorgehensweise? Ich bekomme Produkt, aber ich denke, dass ich es vielleicht verbessern kann, indem ich ändere, was ich dem Master-Mix hinzufüge. Ist es zum Beispiel besser, Taq statt cDNA zum Mastermix hinzuzufügen und dann cDNA hinzuzufügen, bevor ich die PCR starte? Ist es in Ordnung, sowohl cDNA als auch taq zusammen zum Mastermix hinzuzufügen?
Ich füge den Taq immer dem Mastermix hinzu. Erstens erleichtert es die Handhabung und vermeidet Pipettierschritte, die zu Kontaminationen führen und auch vergessen werden können. Dann ist das Enzym sehr stabil und verträgt problemlos auch Raumtemperatur. Da wir diese 30-40 auf 95°C erhitzen werden, ist dies eindeutig kein Problem. Da die Reaktionsmischung abgekühlt ist, startet Ihre Reaktion nicht. Und selbst wenn dies der Fall wäre, würde es aufgrund der niedrigen Temperatur keine große Verstärkung geben.
Normalerweise füge ich dem Mastermix alles hinzu, was für alle Reaktionen gleich ist (dies kann auch die DNA enthalten). Wenn ich mehr als eine DNA verwende, teile ich den Mastermix in zwei Hälften. Auf diese Weise werden Sie keine unterschiedlichen Pipettenfehler für die Vorlage machen, was besonders wichtig für die Realtime-PCR ist. Normalerweise verdünne ich die Primer leicht, damit ich größere Volumina pipettieren kann (einfach einen Teil des Wassers verwenden, das zum Ausgleich der PCR-Reaktion verwendet wird). Sie können auch Primerpaare vormischen, wenn Sie möchten, ich habe noch nie Probleme dabei gesehen.