Ich plane, eine PCR-Reaktion hochzuskalieren, und ich frage mich, ob es ein Problem wäre, die PCR-Röhrchen auf das maximale Volumen von 200 ul zu füllen. Es würde viel weniger Pipettieren bedeuten, da ich nur 1/4 der Röhrchen bräuchte.
Die typischen Protokolle, die ich gesehen habe, verwenden immer 50 ul für eine PCR-Reaktion. Ich frage mich, ob es Probleme mit größeren Volumina gibt, z. B. Unterschiede in der Wärmeübertragung, die Probleme verursachen könnten, wenn ich das Volumen in einem Röhrchen vergrößere.
Ist das Hochskalieren des Volumens problematisch? Irgendwelche besonderen Aspekte, die ich beachten sollte?
(Auch zu lang für einen Kommentar.) Diese Frage erinnerte mich an eine Anekdote von Arthur Kornberg über den Ansatz zum Hochskalieren, der von Reiji Okazaki (Entdecker von Okazaki-Fragmenten ) gewählt wurde.
Hier ist ein Zitat aus For the Love of Enzymes: The Odyssey of a Biochemist von Arthur Kornberg
Reijis Forschungsstil lässt sich nicht ohne Weiteres aus seinen Veröffentlichungen entnehmen, aber er ist mir lebhaft in Erinnerung. Ein Beispiel nenne ich das Okazaki-Manöver. Bei der Reinigung eines Enzyms verwendete er einen Erwärmungsschritt: 10 Milliliter der Enzymlösung wurden in einem Reagenzglas fünf Minuten lang bei 70 °C gehalten; dann wurden die koagulierten Verunreinigungen durch Zentrifugation entfernt. Als er an den Punkt kam, das Verfahren auf mehrere Liter hochzuskalieren, wiederholte er einfach den ursprünglichen Heizvorgang mehrere hundert Mal. Es war mir peinlich, in unserer Veröffentlichung über ein so unausgereiftes Verfahren berichten zu müssen. Aber dann wurde mir klar, dass er diesen Schritt in ein paar Stunden erledigen konnte und sah keinen Sinn darin, kostbare Zeit und Material zu verschwenden, um zu lernen, wie man das Erhitzen in einem großen Becher oder Kolben durchführt. Später, Als ein anderer meiner Studenten ein Enzym mit einem Erhitzungsschritt reinigte und sein Verfahren von 3 Millilitern auf 6 Liter um das 2000-fache vergrößern musste, empfahl ich das Okazaki-Manöver: Er fügte 3 Milliliter in jedes der 200 Reagenzgläser, um die Erhitzung durchzuführen und Zentrifugationsschritt, wobei das Verfahren neunmal wiederholt wird. Ein anderer Student, der versuchte, eine große Menge dieses Enzyms in einem einzigen Schritt zu erhitzen, verlor es in einem dicken Gerinnsel.
Zu lang für einen Kommentar: Ich würde sagen, es kommt auf die PCR an. Ich persönlich habe maximale Volumina von 50 ul verwendet, wenn ich größere Volumina zubereiten musste, machte ich eine Mischung, die anschließend auf mehrere Röhrchen mit max. 50 ul verteilt wurde.
Das Problem bei großen Volumina besteht darin, eine schnelle und homogene Erwärmung und Abkühlung zu erreichen. Wenn die Außenseite des Röhrchens schneller ist, beginnt die Reaktion dort bereits, während dies in der Mitte möglicherweise nicht der Fall ist. Dies kann zu einer ungleichmäßigen Denaturierung und Amplifikation Ihrer Vorlage führen. Letzteres ist besonders problematisch, wenn Sie kurze Sequenzen verstärken. Dort ist die Amplifikationszeit möglicherweise bereits vorbei und das PCR-Programm läuft weiter, bevor die Vorlage fertig ist, was zu weniger Ihrem Produkt in voller Länge und der Anreicherung kürzerer Versionen führt.
Es gibt noch ein weiteres Problem, das bei großen Reaktionen auftreten kann: Aufgrund von Reaktivitätsgradienten aufgrund von Temperaturgradienten halte ich es für möglich, dass Reagenzien (dNTPs, Mg-Ionen) Gradienten bilden können, die eine gute Ausbeute weiter verhindern.
Abschließend habe ich eines an einem unserer PCR-Geräte getestet: Das PCR-Röhrchen wird in den Heiz-/Kühlblock eingesetzt. Es ist nicht vollständig in den Block eingelassen, sondern ragt teilweise heraus. Wenn Sie es also bis zur maximalen Kapazität füllen, wären die oberen 75-100ul (ungefähr) außerhalb des Heizblocks und wir haben ein thermisches Problem. Dort würde sich das Reaktionsgemisch nur durch Konvektion erwärmen.