Grundlegende Schritt-für-Schritt-Methoden für den PCR- und Gelelektrophorese-Kurs

Ich unterrichte bald eine Klasse, wie man PCR und Gelelektrophorese durchführt, und würde mich freuen, wenn Sie meine grundlegenden Schritt-für-Schritt-Anleitungen durchgehen könnten - es ist eine Weile her, seit ich eine gemacht habe. Gibt es dort etwas, das falsch ist, fehlt oder im Folgenden ausgeschlossen werden sollte?

A) Sammeln Sie alle Zutaten aus dem Kühlschrank und halten Sie sie kühl (auf Eis). Lassen Sie das TAQ im Gefrierschrank, bis es benötigt wird.

B) Erstellen Sie einen Mastermix, indem Sie alle Zutaten hinzufügen (ddH20, MgCl2, PCR-Puffer, F-Primer, R-Primer, dNTP) (ohne TAQ)

.......

W) Bringen Sie das Gel zur UV-Kamera und machen Sie ein Foto. Große DNA-Moleküle bewegen sich am langsamsten durch das Gel und sind daher den Vertiefungen am nächsten.

(Die Schüler verwenden Primer, die sie entwickelt haben, um 6 DNA-Proben von 3 Vogelarten zu sexen, Männchen sollten 1 Band und Weibchen 2 Banden im Gel produzieren)

Für die Vollversion siehe die Antwort unten

Zum einen müssen Sie dem Gel einen Farbstoff hinzufügen, um es auf dem UV zu sehen. Ethidiumbromid erfordert Handschuhe und ist giftig. GelGreen/GelRed ist teuer, aber viel sicherer. Denken Sie auch daran, den Mastermix bis zur Verwendung bei -20 ° C gefroren zu halten - aliquotieren Sie ihn, da Sie ihn nicht mehr als etwa 6 Mal erneut einfrieren können - er zersetzt sich.
Danke @shigeta nützlicher Tipp zum Einfrieren und Aliquotieren im mm. Ich habe vergessen, dass der Ladefarbstoff eine vorbereitete Mischung aus Ladefarbstoff und Gel ist
Für ein Lehrlabor möglicherweise nicht erforderlich, aber eine bessere Kontrolle könnte darin bestehen, ein zusätzliches PCR-Röhrchen ohne Template (No Template Control) zu haben, um festzustellen, ob Primer-Dimere oder andere Kontaminationen vorhanden sind. Wenn die Kosten/Verfügbarkeit von Reagenzien ein Problem darstellen, würde eine von einem Schüler durchgeführte Kontrolle wahrscheinlich genug Flüssigkeit liefern, um auf 2+ Gelen zu laufen (da ich annehme, dass viele dieser Reaktionen im selben Thermocycler durchgeführt werden, ist dies immer noch eine vernünftige Kontrolle).
Also die definierte Menge Mastermix verwenden und dann Millipore-Wasser in der gleichen Menge wie die DNA in den Proben zugeben? @A.Kennard
@GriffinEvo Genau, und führen Sie dann zusammen mit allen anderen eine PCR mit dieser Probe durch und führen Sie sie auf dem Gel aus.
Hier ist eine gute Anleitung zur Fehlerbehebung bei der PCR. neb.com/tools-and-resources/troubleshooting-guides/…
Sieht für mich gut aus, mit den Kommentaren, die andere geteilt haben. Ich denke, der wichtigste Teil bei der Vorbereitung eines Labors wie diesem ist nicht nur sicherzustellen, dass Sie anständige Ergebnisse erzielen (obwohl dies bei Mastermixen und dergleichen heutzutage normalerweise ziemlich einfach ist), sondern genau zu wissen, WARUM Sie jeden Schritt ausführen, und in der Lage zu sein, das den Schülern klar zu erklären, damit sie es verstehen. Jeder kann einem Protokoll folgen, aber es braucht eine besondere Person, um das „Wie“ mit dem „Warum“ zu verbinden und alles in einer einheitlichen Geschichte zu erklären. Viel Glück mit Ihrem Labor!
Danke @MattDMo. Ich werde das im Hinterkopf behalten, vielleicht könnte ich sie in Gruppen aufstellen, sie dazu bringen, zunächst das Standardprotokoll zu befolgen, sie dann den PCR-Reaktionsmix und den Thermocycler optimieren lassen, um zu sehen, was das dann bewirkt Lassen Sie sie die Ergebnisse aufschreiben, die die Wirkung beschreiben und erklären, warum sich beispielsweise eine Änderung der Mg++-Konzentration auf das Endprodukt auswirkt.
@GriffinEvo Ich habe den Artikel gelesen, den du darüber auf WordPress geschrieben hast, und ich habe ihn absolut geliebt! Lernen durch Lehren. Weiter so...

Antworten (1)

Ich habe einen Test nach diesem Protokoll buchstabengetreu durchgeführt...

PCR Schritt für Schritt:

  1. Sammeln Sie alle Zutaten (außer TAQ) aus dem Kühlschrank und halten Sie sie kühl (auf Eis). Lassen Sie das TAQ im Gefrierschrank, bis es benötigt wird.
  2. Stellen Sie einen Master-Mix her, indem Sie alle Zutaten (außer TAQ) unter Verwendung frischer Pipettenspitzen für jeden Inhaltsstoff und unter Verwendung des im PCR-Reaktionsmix-Rezept angegebenen Volumens hinzufügen.
  3. Auf einer Zentrifuge vortexen und leicht herunterzentrifugieren.
  4. Fügen Sie die erforderliche Menge TAQ zum Mastermix hinzu (in die Flüssigkeit einführen) und mischen Sie mit der Pipette, um etwas Flüssigkeit nach oben und unten zu ziehen.
  5. Geben Sie Master-Mixe in den erforderlichen Volumina wie im Protokoll angegeben in die beschrifteten PCR-Röhrchen.
  6. Geben Sie erneut DNA in die PCR-Röhrchen (unter Verwendung frischer Pipettenspitzen für jede DNA-Probe) und verwenden Sie dabei das im Protokoll angegebene Volumen. Beschriften Sie Ihre Röhrchen sorgfältig (sowohl auf dem Deckel als auch auf dem Röhrchen).
  7. Drehen Sie die PCR-Röhrchen auf einer Zentrifuge leicht herunter.
  8. Führen Sie die PCR gemäß Ihrem Protokoll im Thermocycler durch.
  9. Sammeln Sie Proben aus dem Thermocycler und legen Sie sie bis zur Verwendung in den Kühlschrank.

Gelelektrophorese Schritt für Schritt:

  1. Machen Sie 1xTAE (ausreichend, um das Agarosegel herzustellen und in das Elektrophoresegerät zu stellen).
  2. Machen Sie ein Agarosegel (ca. 5 mm dick) durch Schmelzen von Agarose und 1xTAE in der Mikrowelle; Lassen Sie die Flüssigkeit etwas abkühlen, bevor Sie sie in die Form geben.
  3. Sobald das Gel abgekühlt ist, legen Sie es in das Elektrophoresegerät, bedecken Sie es mit 1xTAE (gerade das Gel bedeckend) und entfernen Sie dann den Kamm.
  4. Sammeln Sie die PCR-Produkte aus dem Kühlschrank/Thermocycler.
  5. Machen Sie Flecken von Ladefarbstoff auf Parafilm. Der Ladefarbstoff ist mit GelRed vorgemischt, sodass Ihre Proben unter UV-Licht sichtbar sind.
  6. Fügen Sie eine Probe an einer Stelle hinzu, mischen Sie sie, indem Sie die Flüssigkeit in die Pipettenspitze hinein- und herausziehen, und geben Sie sie dann vorsichtig in eine Vertiefung im Agarosegel. Achten Sie darauf, das Gel nicht zu durchstechen oder Flüssigkeit aus der Vertiefung zu verschütten. Entsorgen Sie die Pipettenspitze.
  7. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt für jede Probe und für eine Negativkontrolle (Mastermix und Milli-Q-Wasser anstelle von DNA). Verwenden Sie für jede Probe eine frische Spitze.
  8. Geben Sie die PCR-Leiter, ebenfalls gemischt mit Ladefarbstoff, in eine Vertiefung.
  9. Schließen Sie das Elektrophoresegerät an eine Stromversorgung an, wobei die negative Elektrode (schwarz) den Vertiefungen mit den Proben am nächsten liegt.
  10. Stellen Sie die Stromversorgung auf 80-120 Volt ein.
  11. Warten Sie, bis zwischen dem blauen und dem violetten Band eine etwa fingerbreite Lücke erscheint (ca. 20-30 Minuten).
  12. Trennen Sie die Stromversorgung und sammeln Sie das Gel vorsichtig aus der Flüssigkeit.
  13. Bringen Sie das Gel zur UV-Kamera und machen Sie ein Foto. Große DNA-Moleküle bewegen sich am langsamsten durch das Gel und sind daher den Vertiefungen am nächsten.

Und ein perfektes Ergebnis erzielt...

Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Die Reihenfolge ist Kontrolle, weiblich, männlich, weiblich, männlich, weiblich, männlich, Leiter. Männchen haben ein Band, Weibchen zwei. Das letzte Paar war auf dem Bild nicht allzu gut zu sehen, aber auf dem Bildschirm im Kameraraum deutlich genug. Danke für die Tipps an alle! Entschuldigung, das Bild ist von geringer Qualität.

Fühlen Sie sich frei, diese Richtlinien neu zu erstellen, aber denken Sie daran, die Biology Stackexchange Community zu erwähnen!

das ist Hingabe! Danke, dass du das geteilt hast!
Grundlegende Schritt-für-Schritt-Methoden für den PCR- und Gelelektrophorese-Kurs
AntwortenHierDatenschutz-Bestimmungen1y, 0v