Wie verbreitet ist die Taq-Polymerase beim Hinzufügen von 3'-A-Überhängen zum PCR-Produkt?

Ich führe eine Mutagenese an einem Gen in vivo durch, das ich in einen Expressionsvektor ligieren muss. Die Primer, die ich entworfen habe, überlappen Restriktionsstellen, von denen ich plane, sie zu verwenden, um sie in den Expressionsvektor zu ligieren. Die Teile zwischen den Primern werde ich versuchen, Mutanten mit fehleranfälliger PCR zu erzeugen.

Meine Sorge gilt den 3'A-Überhängen, die von der Taq-Polymerase erzeugt werden. Wie verbreitet ist das? Wenn es sehr häufig vorkommt, wie kann ich diese Zusätze am besten berücksichtigen, wenn ich versuche, mein PCR-Produkt in den Vektor zu ligieren?

Antworten (2)

Ich bin mir nicht sicher, ob Taq keine 3 'A-Überhänge hinzufügt.

Sie könnten TA-Klonierung verwenden, um Ihr PCR-Produkt zu klonen. Das Grundprinzip besteht darin, einen Vektor mit 3'-T-Überhängen zu verwenden. Wenn Sie einen Vektor ohne diese Überhänge haben, können Sie eine Terminale Transferase + dTTPs verwenden, um sie zu erstellen (oder sogar Taq, aber das ist nicht so toll, weil es einen Reinigungsschritt hinzufügt, um die Vektoren mit Überhängen zu isolieren; Terminale Transferase ist viel effizienter ). Sie können dann Ihr PCR-Produkt ligieren, das einen 3'-Überhang hat.

Protokolle zum Hinzufügen der 3'-T-Überhänge zu Ihrem Vektor sind in Zhou und Gomez-Sanchez 2000 angegeben .

T4-Polymerase fügt keine Überhänge hinzu (sie fügt sie hinzu, löscht sie dann aber), aber ich denke, diese Polymerase hat eine zu hohe Genauigkeit für die Mutagenese.
Soweit ich weiß, fällt der A 'Überhang schließlich ab. Das Klonen von TA ist jedoch ein viel einfacherer Weg, wenn Sie einen TA-Vektor haben.
@Kevin: Ich habe meine Antwort überarbeitet, um eine Beschreibung des TA-Klonens aufzunehmen, das überhaupt keine T4-Polymerase beinhaltet. (Ich nehme an, Sie haben den Buchstaben A mit der Zahl 4 verwechselt.)
Wenn Restriktionsstellen das PCR-Produkt flankieren, können Sie in jedem Fall einen Restriktionsverdau und eine Ligation durchführen. Wenn Sie wegen des A-Überhangs zu besorgt sind, können Sie die Pfu-Polymerase für die PCR verwenden oder alternativ das PCR-Produkt mit Klenow behandeln.

Verwenden Sie pGemT , um Ihr PCR-Produkt darin zu klonen. Es ist genau so konzipiert, dass es Produkte mit 3 'Überhängen aufnehmen kann, und verfügt über eine Blau/Weiß-Auswahl, so dass es ziemlich einfach zu machen ist! Dann würden Sie pGem mit den Restriktionsstellen, die Sie während Ihrer PCR hinzugefügt haben, ausschneiden und in Ihren Expressionsvektor ligieren.

Wie verbreitet ist die Taq-Polymerase beim Hinzufügen von 3'-A-Überhängen zum PCR-Produkt?
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