DNA-Länge und Annealing-Kinetik

Ich habe eine Mischung aus Plasmiden und unerwünschten kurzen linearen Fragmenten, die dieselben Sequenzen aufweisen. Während der Denaturierung und des Annealens möchte ich, dass sich die Plasmide „finden“, bevor sie sich an die kürzeren linearen Fragmente anlagern. Unter der Annahme, dass die Konzentration kürzerer Fragmente signifikant ist, gibt es ein Temperaturprofil, das in Richtung erneutes Annealing längerer DNA tendiert?

Genauer gesagt handelt es sich hierbei um eine Variante des Surveyor-Mutationsnachweisassays, bei dem erneut annelierte DNA mit Fehlpaarungen verdaut wird, wobei nicht mutierte DNA intakt bleibt. Ich möchte nicht-mutierte Plasmide für die E. coli-Transformation behalten. Allerdings sind einige lineare Fragmente von etwa 10–50 % der Länge des Plasmids der Exonukleasebehandlung entgangen und würden während des Annealens mit den Plasmiden konkurrieren.

Es ist unklar, was Sie fragen. Und warum nicht transformieren e. coli mit Ihrer Mischung vermehren sich nur kreisförmige Plasmide und lineare Stücke werden abgebaut/ausgereinigt
Wenn sich die linearen Fragmente anstelle des Komplements an die zirkulären Plasmide anlagern, wäre die resultierende DNA nur teilweise doppelsträngig, was sie meiner Meinung nach für Bakterien unbrauchbar machen würde. Dies würde die Transformationseffizienz verringern.
Haben Sie daran gedacht, nur DNAse zu verwenden, die auf ssDNAs abzielt? Zum Beispiel Mungobohnen-Nuklease . Es sollte ein anderes Enzym mit ähnlicher Aktivität geben, zB S1
Ich verwende PlasmidSafe, einen Cocktail aus Exonukleasen, die das tun. Es ist einfach nicht 100% effizient und ich wollte keinen Raum für Fehler lassen.

Antworten (1)

Kurze Antwort ist, dass eine höhere Temperatur das Ausheilen längerer Sequenzen begünstigt. Es gibt verschiedene Möglichkeiten , die Schmelztemperatur zu berechnen, aber alle führen zu ähnlichen Ergebnissen: Längere Polymere erfordern mehr Wärmeenergie zum Schmelzen. Daher wird ein schnelles Abkühlen von höher (z. B. von 95 °C, Thermocycler kann in 10–12 Sekunden abkühlen ) auf RT/4 °C das erneute Tempern von kreisförmigen Strängen begünstigen. Langsameres Abkühlen sollte mehr ssDNAs binden lassen.

Aber noch einmal, wenn das Endziel darin besteht, nach zirkulärer dsDNA zu selektieren, sollte eine einfache Transformation dafür sorgen.

Danke für die Antwort! Wie wäre es mit einem langsamen Abkühlen auf etwas unterhalb der Schmelztemperatur des Plasmids und dann einer schnellen Kühlung auf Eis von dort aus?
Außerdem ist längere DNA im Gegensatz zu Oligonukleotiden flexibel und enthält lokale Regionen mit höheren und niedrigeren Schmelztemperaturen. Würde die Gesamtschmelztemperatur in diesem Fall genau beschreiben, dass die Hälfte der ssDNA-Moleküle vollständig geglüht ist? Mit anderen Worten, wäre es üblich, dass zwei ssDNA-Moleküle unvollständig an dieselbe Matrize angelagert sind, wobei eines der Moleküle das andere teilweise blockiert?
Ich weiß nicht, was wirklich möglich ist. Richtig ist, dass bei jeder Temperatur eine Wechselwirkung mit mehr Basen günstiger ist. Betrachten Sie es als ein dynamisches Gleichgewicht: In jedem Moment werden ssDNAs binden/versuchen zu binden und sich zu lösen. Es sind jedoch nur Dutzende von Basen erforderlich, um das gesamte Oligo zu lösen, während zirkuläre DNA in der Größenordnung von KBs liegt. Oligo wird sich also viel leichter lösen und in Lösung gehen als der zweite Strang einer zirkulären dsDNA
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