Warum wird EcoRI mit einem einzigartigen Puffer geliefert, wenn dieser angeblich zu 100 % in Universalpuffern aktiv ist?

Thermo verpackt einen einzigartigen Puffer mit EcoRI:

  • 50 mM Tris-HCl (pH 7,5)
  • 10 mM MgCl 2
  • 100 mM NaCl
  • 0,02 % Triton X-100
  • 0,1 mg/ml BSA

Sie führen ihr EcoRI-Enzym jedoch auch als 100 % aktiv in Puffer O ohne angezeigte Sternaktivität auf:

  • 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 bei 37 °C)
  • 10 mM MgCl 2
  • 100 mM NaCl
  • 0,1 mg/ml BSA

Dasselbe gilt für 2X Tango:

  • 66 mM Tris-Acetat (pH 7,9 bei 37°C)
  • 20 mM Magnesiumacetat
  • 132 mM Kaliumacetat
  • 0,2 mg/ml BSA

Gibt es einen Grund, warum man lieber den eindeutigen Puffer als einen universellen verwenden würde? Angesichts der Tatsache, dass Pufferkompatibilität ein Hauptverkaufsargument für Restriktionsenzyme ist, warum sollten sie weiterhin einen einzigartigen Puffer liefern?

Ich freue mich auf die Erklärung, warum dies eine Hausaufgabenfrage ist ...
Ich auch. Ich denke, das ist eine berechtigte Frage. Und ein interessantes obendrein.
Interessanterweise wird für das Fast-Digest-System ein Universalpuffer (grün) empfohlen.
@Chris Danke. Sind die Fast Digest Enzyme konstruiert? Ich weiß, dass NEB zwei EcoRI-Enzyme anbietet: reguläre und High-Fidelity-Enzyme. Letzteres wurde für eine hohe Aktivität in Universalpuffern entwickelt. Für Thermo ist ihr "normales" EcoRI anscheinend in mehreren Universalpuffern aktiv und wird tatsächlich mit dem einzigartigen Puffer und Tango Universal geliefert.
Die Zusammensetzung der Schnellverdauungspuffer wird nicht offengelegt ... Ich habe ein Papier gefunden, das das Vorhandensein von Triton X-100 mit einer geringeren Sternaktivität in Verbindung bringt, aber sie verwenden eine viel höhere Konzentration, siehe hier .
Ich habe den Verdacht, dass der einzigartige Puffer technisch der beste ist, aber das Enzym ist auch in den universellen Puffern fast vollständig aktiv und zeigt eine vernachlässigbare Sternaktivität, sodass sie es der Einfachheit halber nur als 100% aktiv auflisten. Ich kann ihrem technischen Support eine kurze E-Mail schreiben, um zu sehen, ob sie das klären können.
Wenn Sie dies tun, teilen Sie uns dies bitte mit, wenn Sie eine Antwort erhalten, die uns etwas sagt (obwohl ich das bezweifle).
@Chris werde ich machen.
Ich würde Ihrem Gedanken +1 geben, um den technischen Support zu fragen; Sie haben wahrscheinlich mehr technische Daten als die meisten Benutzer, die meisten Benutzer werden wahrscheinlich nur sagen "Oh ja, es hat bei mir in _____ Puffer gut funktioniert", ohne einen quantitativen Vergleich mit einem Dutzend Pufferzusammensetzungen zu haben. Ich verwende in meiner Arbeit keine Restriktionsenzyme, aber ich vermute, dass sie es mit dem Triton X liefern könnten, um es in Lösung zu bringen, wenn es am Versorgungsgefäß haften könnte. Die anderen Puffer könnten gut funktionieren, aber mit ein wenig Triton X sind sie sicher, dass alles in Lösung ist und daher zuverlässigere Ergebnisse liefert.
@canadianer Ich erwarte, dass Sie 100% der aufgelisteten Einheiten als Aktivität in allen Puffern erhalten, aber dass Sie mehr Aktivität erhalten können, wenn Sie den eindeutigen Puffer verwenden. Wer könnte das brauchen? Keine Ahnung...
@Chris Falls Sie interessiert sind, habe ich den technischen Support kontaktiert und die Antwort unten aktualisiert. Anscheinend kann es Sternaktivität in den universellen Puffern zeigen, obwohl dies nicht aufgeführt ist.
@canadianer Cool danke. Ich finde das interessant, und der Verdacht, dass es mit Sternenaktivität zu tun haben könnte, ist richtig.

Antworten (1)

Die Aktivität gegenüber der gewünschten Substratsequenz ist nicht das einzige Anliegen bei der Bewertung eines Restriktionsenzym-Puffersystems. Darüber hinaus müssen Sie sich um die sogenannte „ Star-Aktivität “ oder Aktivität des Enzyms gegenüber anderen, nicht gewünschten Nukleotidsequenzen kümmern.

Zum Beispiel liefert NEB einen enzymspezifischen Puffer für sein Standard- EcoRI , obwohl es 100 % Aktivität in Puffer Nr. 2 der Standardpufferserie von NEB auflistet. Aber ganz unten auf der Seite steht dieser Hinweis: „Kann Sternaktivität in NEBuffer 2.1 oder CutSmart Buffer aufweisen.“

Promega hat eine ähnliche Warnung bezüglich seines „MULTI-CORE“-Puffers – obwohl EcoRI in diesem Puffer 100 % Aktivität aufweist. Der MULTI-CORE-Puffer wird aufgrund der Star-Aktivität nicht empfohlen – Spaltung an nicht standardmäßigen Stellen.

Auf dem Produktdatenblatt ist es ein wenig versteckt, aber Thermo Scientific erwähnt die Star-Aktivität im Standard-„Tango“-Puffer und erwähnt die Star-Aktivität mit Überverdauung im Standard-„R“-Puffer. Es gibt keine Warnung vor Puffer „O“, aber angesichts der Neigung von EcoRI zu Star-Aktivität, vermute ich, dass dies ein Teil der Gründe ist, warum sie einen einzigartigen Puffer für den routinemäßigen Gebrauch empfehlen. Angesichts der Häufigkeit, mit der EcoRI in der Molekularbiologie verwendet wird, lohnt es sich, einen benutzerdefinierten Puffer zu verwenden, um die Sternaktivität so gering wie möglich zu halten.

Von Canadianer: Ich habe den technischen Support von Thermo kontaktiert. Trotz der Tatsache, dass Star-Aktivität weder für 2X Tango noch für Buffer O in den Produktdaten für EcoRI als besorgniserregend aufgeführt ist, sagen sie, dass es tatsächlich eine gewisse Star-Aktivität in diesen universellen Puffern geben könnte, weshalb sie weiterhin den einzigartigen Puffer liefern für dieses Enzym.

Danke für deine Antwort. Ich hätte in meiner Frage klarstellen sollen, dass Thermo keine Sternaktivität sowohl für Buffer O als auch für 2X Tango anzeigt. Wie ich in den Kommentaren erwähnt habe, vermute ich, dass Sie Recht haben, dass die Sternaktivität im einzigartigen Puffer minimiert wird, während es in den universellen Puffern einen höheren Grad (vernachlässigbar?) geben kann.
Warum wird EcoRI mit einem einzigartigen Puffer geliefert, wenn dieser angeblich zu 100 % in Universalpuffern aktiv ist?
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