Beschränkungsstellen

Ich würde gerne wissen: Wie viele Restriktionsstellen verwendet ein Restriktionsenzym auf einem DNA-Molekül? Mit anderen Worten: Enthält eine Sequenz auf einem Plasmid folgende Basen:

ATT GCAGT CTG

und ich möchte nur die fett gedruckten Basen als neues, separates Molekül haben, brauche ich zwei Restriktionsenzyme (eines, um das Molekül zwischen T und G zu schneiden, und ein anderes, um es zwischen T und C zu schneiden)? Oder ein Restriktionsenzym (das sie beide schneidet)?

Es war nicht klar genug in Wikipedia und in meinem Biologiebuch.

Willkommen bei Biologie SE. Verstehe ich richtig, dass Sie die fettgedruckte Sequenz entfernen möchten, dh Schnitte mit stumpfen Enden, die zu einem Oligonukleotid von 5 Basenpaaren und dem Rest führen? Die Plasmidfrage - bitte googeln...
Ja. Ich habe eine Frage zu einem Plasmid, das nur durch einen Restriktionsverdau geschnitten wird, und ich möchte wissen, ob es dieselbe Größe behält ...
Das ergibt keinen Sinn ... Ihr Kommentar ist eine ganz andere Frage. Bitte seien Sie in Ihrer Frage konkret .
Ich habe ein Plasmid (soweit ich weiß - eine runde Form einer DNA-Sequenz in Prokaryoten). Ein Restriktionsverdau schneidet es ab - an ein oder zwei Stellen. Wenn es nur an einer Stelle geschnitten wird, ändert sich die Größe des Plasmids nicht, es öffnet sich einfach, weil es rund ist. Wenn es an zwei Stellen geschnitten wird, gibt es ein geschnittenes Plasmid und ein neues Oligonukleotid.
Bitte fügen Sie Ihrer Frage das Restriktionsenzym hinzu, das würde helfen. Es ist alles zu abstrakt
Tut mir leid, ich habe das Wort "digest" mit "restriction" verwechselt... Englisch ist nicht meine Muttersprache. Ich habe meine Frage bearbeitet. Ich hoffe es wird jetzt klar.
Welches Enzym verwendest du für diesen Versuch? Einige (aber seltene) Enzyme erkennen eine bestimmte Sequenz und schneiden ein DNA-Fragment heraus, indem sie beide Enden der Sequenz verdauen.
Ja, bakterielle Plasmid-DNA existiert als kovalent geschlossene Kreise, sowohl in vivo als auch nach Isolierung und Reinigung. WENN: das Plasmid eine oder mehrere Erkennungsstellen für das von Ihnen verwendete Restriktionsenzym enthält, DANN: ja, wenn Sie die Empfehlungen des Herstellers für den Restriktionsenzymverdau der Zielsequenz(en) auf dem Plasmid befolgen, sollten Sie genau beobachten zu 100 % Verdau (dh Einführung eines doppelsträngigen Schnitts in die DNA) an allen Stellen. Also 1 Site = 1 (lineares Fragment voller Länge), 2 Sites = 2 Fragmente, 3 Sites = 3 Fragmente usw.
Typ-II-Restriktionsenzyme erkennen immer Palindromsequenzen und die Enzyme dimerisieren, sodass beide Stränge, Watson und Crick, fast zur gleichen Zeit gespalten werden, jeder durch ein Molekül im Dimer.
Ich verwende die Enzyme ecoRI und BamHI. Wie viele Erkennungsstellen haben sie?
Ich verstehe vielleicht nicht ganz, was Sie tun möchten, aber wenn Sie nur diesen kurzen fetten Teil brauchen, warum lassen Sie sich nicht ein Oligo synthetisieren und ersparen sich die Mühe des Schneidens und Reinigens? Und wenn Sie nur diesen winzigen Teil herausschneiden, werden Sie keinen Größenunterschied auf dem Plasmid bemerken.
Meine Frage war theoretisch. Ich brauche kein neu synthetisiertes Molekül, sondern eine zu schneidende Sequenz. Ich möchte nur wissen, ob ein Restriktionsenzym eine Sequenz aus einem Plasmid schneiden kann (und es nicht nur zu einer Kette öffnet). Ich habe die obige Sequenz nur als Beispiel eingefügt (ihre tatsächliche Größe ist viel größer). In meinem Kurs gibt es eine Frage zu Restriktionsenzymen, und ich würde diese gerne wissen, um sie zu beantworten.

Antworten (2)

Die meisten Restriktionsenzyme haben eine 6-bp-Restriktionsstelle (einige haben auch eine 8-bp-Stelle). Daher müssen zwei Restriktionsstellen im Allgemeinen 12 bp überspannen. Einige Restriktionsstellen können sich jedoch überlappen. Zum Beispiel BamHI und SmaI:

BamHI
| ______ |
GGATCCCGGG
    | ______ |
     Klein

In diesem Fall hat sich die Gesamtlänge auf 10 bp reduziert. Solche Kombinationen sind jedoch nicht so häufig und Sie erreichen maximal eine Überlappung von 2-3 bp. Eine Restriktionsendonuclease macht nur einen einzigen Schnitt. Um Doppelschnitte durchzuführen, benötigen Sie zwei Restriktionsstellen.

Selbst wenn sich die Stellen nicht überlappen, muss eine Mindestlänge der Trennung eingehalten werden, da sonst die Bindung eines Enzyms die Bindung des anderen Enzyms bei einem doppelten Verdau behindert. Eine Lücke von 6 Nukleotiden zwischen den Restriktionsstellen sollte in Ordnung sein. Wenn keine Lücke vorhanden ist, ist der doppelte Digest möglicherweise nicht sehr effizient.

Sie können auch zwei Restriktionsstellen desselben Enzyms haben, so dass Sie nicht zwei separate Enzyme verwenden müssen.

Übrigens hat die Sequenz in Ihrer Frage keine Restriktionsstelle.

Hoffe das beantwortet deine Frage.

Um die Frage noch einmal zu beleuchten: Ein Restriktionsenzym schneidet eine doppelsträngige DNA zweimal, aber es schneidet sie nur einmal auf jedem Strang.

Also ja, Sie würden zwei verschiedene Restriktionsenzyme benötigen, um die fettgedruckte Sequenz herauszuschneiden (vorausgesetzt, Sie möchten diese Sequenz in doppelsträngiger Form): ein Enzym, das zwischen T und G auf dem von Ihnen dargestellten Strang schneiden würde, und eine, die zwischen dem T und dem C auf demselben Strang schneiden würde.

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