Sind Restriktionsenzyme bei −20 °C aktiv?

Ich habe meine DNA mit NotI-Enzym verdaut und sie in den –20 °C-Gefrierschrank gelegt, ohne dass Hitze sie inaktiviert. Können Restriktionsenzyme bei −20 °C arbeiten? Muss ich mit STAR-Aktivität rechnen?

Ich würde trotzdem empfehlen, das Enzym zu inaktivieren oder die Reaktion nach dem Auftauen zu bereinigen.
Was ist Sternenaktivität? bitte vermeiden Sie Akronyme amap danke y othrws t bcms unintellgbl
@AliceD Star-Aktivität ist ein ziemlich gebräuchlicher Begriff. Es bezieht sich auf den unspezifischen Verdau durch Restriktionsenzyme.
@ AliceD Star-Aktivität ist kein Akronym, sondern lediglich Restriktionsenzym-Jargon. -Bearbeiten-Ninjad.
Die Großbuchstaben ließen es wie ein Akronym aussehen :) Danke Jungs

Antworten (2)

Enzyme haben Temperaturoptima basierend auf dem Organismus, aus dem sie isoliert wurden. Ich würde also vorhersagen, dass es bei –20 °C praktisch keine Aktivität gibt. Eine weitere Überlegung ist, dass die Reaktionen wahrscheinlich festgefroren sind, was die Diffusion einschränken und auch verlangsamen würde. Aber die eigentliche Frage ist: Wovor hast du Angst? Nur die Star-Aktivität? Selbst wenn es Sternaktivität gäbe, würde das Ihre Experimente beeinträchtigen?

Ich weiß es nicht, ich hatte noch nie Star-Aktivität. Ihre Antwort macht Sinn und ich denke auch so, aber ich habe die Frage hier gepostet, weil es im Internet keine Antwort darauf gab und ich dachte, vielleicht hat hier jemand Erfahrung damit.
@mdperry Sie sollten das in Ihrer Antwort aktualisieren und vielleicht einige Auszüge daraus aufnehmen, es ist eine großartige Ergänzung.

Obwohl es unwahrscheinlich ist, dass das Enzym aktiv ist, wenn es eingefroren ist, gibt es bessere Methoden, um die Star-Aktivität zu verhindern.

1: Wenn Sie die Reaktion in einer PCR-Maschine durchführen, können Sie die Maschine vor dem Aufschluss so programmieren, dass sie sich nach dem vorgesehenen Zeitrahmen für den Aufschluss 10 Minuten lang auf 65 Grad erwärmt, um NotI durch Hitze zu inaktivieren. Da NotI ein hitzelabiles Enzym ist, verhindert dieses die Sternaktivität, indem es es denaturiert.

2: Sie können NotI-HF verwenden , das von NEB entwickelt wurde, um die Menge an Sternaktivität stark zu reduzieren, und kann daher über Nacht bei 37 °C inkubiert werden.

3: Sie können Ihre verdauten DNA-Proben gelreinigen oder eine "PCR-Reinigung" durchführen, dies entfernt auch vorhandenes Protein und verhindert somit die Star-Aktivität.

@WYSIWYG Warum aber die Angstzitate?
Zusätzlich können Sie die Reaktion in PCR-Gefäßen im Thermocycler laufen lassen. Wählen Sie einfach die gewünschte Temperatur und erhöhen Sie anschließend die Temperatur auf 10 Minuten bei 65 °C. Keine zusätzliche Arbeit erforderlich und sehr bequem.
@Chris Genau das meinte ich. Entschuldigung für die Unklarheit. Bearbeitete Antwort.
@Chris WYSIWYG hat die Antwort auf "PCR-Reinigung" bearbeitet (Sie können das Protokoll überprüfen). Ich war mir nicht sicher, warum dies so formatiert war.
Ach, jetzt. Normalerweise führe ich diese Reaktionen in PCR-Röhrchen im Thermocycler durch, weil das Volumen sowieso klein ist und es sehr praktisch ist.
@MarchHo die Anführungszeichen, weil es nicht wirklich ein Standardname des Verfahrens ist, denke ich. Dieser Begriff wird von Qiagen populär gemacht :P Sie können ihn entfernen, wenn Sie möchten.
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