Klonproblem. Der Verdauungstest am Ende des Klonens ist immer negativ

Ich habe ein Problem mit meiner Klonierung, ich versuche, einen 483 pb großen pSecTag-Vektor mit den Restriktionsstellen HindIII und BamHI zu klonen. Hier sind die Verfahren, die ich mache:

• Ich führe die Restriktionsstellen BamHI und HindIII in mein Insert durch PCR mit Pfu (blunt end polymerase) ein und gelgereinigt es.
• Ich kloniere mein Insert in einen pJET1.2/blunt-Vektor. Ich bekomme genug Kolonien und ich habe einige davon mit einem internen Insert-Primer und einem Vektor-Prime über PCR getestet. Die Ergebnisse sind positiv.

Das Problem trat auf, als ich mein Insert von pJET verdaute und versuche, es in einen pSecTag-Vektor zu klonen.

• Ich verdaue mein Insert und den Vektor mit HindIII und BamHI in Buffer Red während 1,5 Stunden bei 37ºC (Fermentas). Ich reinige das Insert und den Vektor aus dem Gel und prüfe, ob alle Fragmente in der richtigen Größe auf einem Gel laufen. Alles richtig.

• Ich mache die Ligation (T4-DNA-Ligase) mit einem 5:1-Insert:Vektor und weniger als 100 ng Gesamt-DNA. Die Ligatur (20 ul) wird 30 Minuten lang bei 22ºC durchgeführt. Ich bekomme wenige oder keine transformierten Kolonien. Wenn ich Kolonien bekomme, habe ich sie per PCR getestet:

** • Bei internen Primern ist das Ergebnis positiv

  • Mit einem Primer für den Vektor ist das Ergebnis negativ.
  • Das Seltsamste ist, dass ich positive Ergebnisse erhalte, wenn ich pJET-Primer verwende, die nicht im pSecTag annelieren.**

Für die Transformation verwende ich chemokompetentes DH5-alpha, mit einem Hitzeschock von 42°C bei 45 Sekunden. Ich habe die Bakterien vor dem Einsatz mit einem Plasmid getestet.

Ich ändere mehrmals die Bedingung, erhalte aber immer das gleiche Ergebnis. Ich befolge alle Protokolle, aber ich bekomme meine Konstruktion nicht.

Weiß jemand wo das Problem liegt? Vielen Dank.

Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Es hört sich so an, als wäre der Einsatz noch in pJET, nicht wahr? Besteht die Möglichkeit, dass Sie die beiden Vektoren irgendwo in Ihrem Reinigungsschritt nach dem Verdau gemischt haben? Anstelle von PCR könnten Sie versuchen, eine Restriktionskarte zu erstellen.
Danke für eure Antworten Ja, der Einsatz ist noch im pJET. Eines der Male, als mir das passierte, habe ich es verdaut und die Bänder stimmten mit meinem Insert und dem pJET überein. Ich habe es nacheinander gesendet und das Ergebnis war das gleiche. Es besteht keine Möglichkeit, die Vektoren gemischt zu haben, da ich angesichts der Probleme, die ich hatte, die Schritte an verschiedenen Tagen durchgeführt habe, um Missverständnisse bei der Manipulation zu vermeiden.
Warum klonen Sie es unverblümt zuerst in pJET?
Ich kann mein PCR-Insert nicht direkt verdauen, das RE kann nicht schneiden.

Antworten (1)

Selbst winzige Mengen unverdauten Vektors kontaminieren Ihre Transformation. Sie könnten Ihr Insert aus dem pJet-Klonierungsplasmid PCR-amplifizieren und dann das PCR-Produkt mit BamHI und HindIII verdauen. Um die pJet-Vorlage loszuwerden, reinigen Sie entweder den verdauten Einsatz mit Gel, verdauen Sie pJet mit einigen Malen, wodurch es mehrmals geschnitten wird (weniger bevorzugt), oder geben Sie alles auf eine Säule und hoffen Sie, dass pJet ausreichend verdünnt ist (weniger zeitaufwändig, aber etwas riskant).

Die andere Sache, die Sie ausnutzen könnten, ist, dass pJet Ampicillin-resistent ist, während Ihr Zielvektor auch Zeocin-resistent ist. Wenn Sie Ihrem E. Coli Zeocin hinzufügen, wird es einen pJet-positiven Klon töten, während die pSecTag-positiven Klone verschont werden.

Ihr Einsatz ist ziemlich klein, daher schadet es nicht, etwas mehr DNA als gewöhnlich zu verwenden.

Wenn Sie einige Bilder Ihrer Gele posten können, könnte dies auch hilfreich sein.

Vielen Dank. Ich dachte daran, das zu tun, durch PCR zu amplifizieren, es zu verdauen und aus dem Gel zu reinigen. Oder versuchen Sie es auch mit sequentieller Verdauung. Ich muss eine Kontamination haben, aber es ist schwierig zu wissen, wo. Ich würde ein Foto der Gele hochladen, aber ich weiß nicht wie.
Klonproblem. Der Verdauungstest am Ende des Klonens ist immer negativ
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