Ich bin auf der Suche nach einem hochkompetenten E. coli-Stamm. Ich erstelle eine Bibliothek mit einem Plasmid von ~ 6,6 kb und erreiche keine ausreichend hohe Effizienz. Hat jemand einen Vorschlag für einen Stamm/Protokoll mit ultrahoher Effizienz (>10 10 ).
Dies ist eine großartige Frage, da ich gerade meine eigenen chemisch kompetenten "Homebrew" -Zellen hergestellt habe.
Es gibt eine Vielzahl von E. coli- Stämmen, die üblicherweise zum Klonen verwendet werden. Sie können chemisch durch Hitzeschockverfahren oder elektrisch durch Elektroporation umgewandelt werden (eine kurze Zusammenfassung finden Sie hier ). Diese können im Labor manuell hergestellt oder im Handel von seriösen Anbietern erworben werden (ich empfehle Invitrogen/Life Tech, NEB, Promega).
Chemische Kompetenz wird unter Verwendung des Hanahan -Verfahrens oder einer Variation davon erreicht. Das Verfahren umfasst das Waschen der Bakterien in einer Reihe von Puffern, die verschiedene zweiwertige Kationenchloridsalze (CaCl 2 , RbCl 2 usw.) enthalten. Kommerziell erhältliche E. coli werden als "regulär" und "ultrakompetent" verkauft und reichen von 10 6 bis 10 6 für regulär, und der höchste Wert, den ich gesehen habe, ist 10 10 cfu/µg DNA. Für maximale Effizienz, insbesondere da ein kleines Plasmid wie Ihres leicht zu transformieren ist, ist die Elektroporation eine effizientere Technik, erfordert jedoch eine spezielle Ausrüstung . Elektroporation kann >10 ergeben10 KBE/µg . Für standardmäßige Klonierungspraktiken sind normale oder chemisch kompetente E. coli mit hoher Effizienz vollkommen ausreichend. Da Sie erwähnt haben, dass Sie eine Bibliothek erstellen, möchten Sie sicherlich mit ultrahocheffizienter chemischer Transformation oder, wenn Sie über die erforderliche Ausrüstung verfügen, Elektroporation gehen. Ich habe keine berichteten Elektroporationseffizienzen von > 5 × 10 10 gesehen .
Transformationseffizienzen werden standardisiert, indem eine Rate als Anzahl der koloniebildenden Einheiten (cfu) pro ug eines Kontrollplasmids, typischerweise pUC19, angegeben wird. Die Transformationseffizienz ist sehr empfindlich gegenüber vielen Faktoren, einschließlich Hitzeschockzeit, Kühlzeiten, Auftauzeit, Menge und Größe der Plasmid-DNA. Wenn alle Dinge gleich sind, sind Größe und Menge der DNA für Ihre Zwecke wichtig. Die Transformationseffizienz nimmt im Allgemeinen mit der Menge an DNA zu, aber es gibt einen Sättigungspunkt, und schließlich verringert das Vorhandensein von zu viel DNA die Ausbeute. Außerdem nimmt die Effizienz linear mit der Plasmidgröße ab. Zum Beispiel ist pUC19, der Kontrollvektor, ~2,7 kbp groß und Ihr Bibliotheksplasmid ist ~6,6 kbp groß, also sollten Sie damit rechnen, dass Sie bei der gleichen DNA-Masse 60 % Transformation aufgrund der Plasmidgröße verloren haben.
Ich habe gehört, dass Epi300 elektrokompetente Zellen ( 1 ) von Epicenter sehr effizient sind: > 1 x 10 10 cfu/µg pUC19. Dan Gibson verwendete sie in seiner Arbeit für die Synthese des mitochondrialen Genoms ( 2 ). Wir haben auch überlegt, sie für unsere Montagen zu verwenden, aber sie sind ziemlich teuer.
1. TransforMax™ EPI300™ Elektrokompetente E. coli
2. Chemische Synthese des mitochondrialen Mausgenoms, Gibson et. Al.
Benutzer560