Wird diese Strategie funktionieren, um das erfolgreiche Klonen eines DNA-Fragments in einen Plasmidvektor zu verifizieren?

Ich stehe also etwas unter Zeitdruck. Im Wesentlichen fügte ich ein DNA-Fragment durch molekulares Klonen ein, das eine einzigartige RE-Stelle enthält. Ich muss bestätigen, ob meine Kolonie das Fragment hat oder nicht. Ich muss dies an einem Tag tun, also würde dies als Bestätigungsstrategie funktionieren:

  1. Wählen Sie eine Kolonie aus und führen Sie eine Kolonie-PCR mit Primern um die RE-Stelle herum durch.
  2. Reinigen Sie das PCR-Produkt und verdauen Sie es mit dem eingesetzten Enzym.
  3. Laufen Sie auf einem Gel. Wenn ein Schnitt bemerkt wird, bestätigt dies, dass die Kolonie das eingefügte Fragment (das die RE-Stelle enthält) hatte.

Würde diese Strategie funktionieren? Gibt es irgendwelche bemerkenswerten Probleme, die die Leute in dieser Strategie sehen können?

Antworten (2)

Ja, Ihre Strategie würde funktionieren, mit den bereits von @Cell erwähnten Einschränkungen.

Je nachdem, welches Restriktionsenzym und welchen PCR-Puffer Sie verwenden, können Sie möglicherweise sogar Schritt 2 überspringen. NEB hat eine gute Liste über ihre Restriktionsenzyme und ihre Aktivitäten in einigen gängigen PCR-Puffer. Mit einiger Begründung gelten diese Informationen oft auch für Restriktionsenzyme anderer Marken.

Abhängig von Ihrer Primerverfügbarkeit besteht eine weitere schnelle Strategie darin, einfach ein Primerpaar zu verwenden, bei dem ein Primer innerhalb Ihres Fragments bindet und der andere an das Rückgrat bindet. Dies sollte nur dann zu einem PCR-Produkt führen, wenn Ihr Klonen erfolgreich war, und auch die korrekte Richtung verifizieren (falls Sie stumpfes Ende oder Single-Site-Klonen verwendet haben). Zwei mögliche Probleme bei diesem Ansatz sind:

  1. Wenn Sie überhaupt keine Banden erhalten, wissen Sie möglicherweise nicht, ob das Klonen oder die PCR-Reaktion fehlgeschlagen ist. Letzteres lässt sich mit einer gut durchdachten PCR-Positivkontrolle leicht kontrollieren.
  2. Sie können Fälle entdecken, in denen mehr als eine Kopie Ihres Fragments eingefügt wurde. Obwohl solche Fälle selten sind, kommt es manchmal vor, dass invertierte Wiederholungen von 3, 5, 7, ... usw. Kopien im Tandem eingefügt werden.

Ein Problem ist, wenn Ihr amplifiziertes Fragment zu klein ist, können Sie das positive Ergebnis von zwei Banden möglicherweise nicht sehen, da sie vom Gel ablaufen. Außerdem kann das RE ein kleines Fragment möglicherweise nicht effizient schneiden.

Ich würde empfehlen, das Plasmid zu extrahieren und zu reinigen und dann einen doppelten Verdau mit dem einzigartigen Fragment zu machen, das RE und ein RE schneidet, das nur das Rückgrat schneidet. Sie sollten entweder linearisierte Plasmid-DNA oder zwei Banden sehen, die wahrscheinlich beide >1 kb groß und leicht auflösbar sind.

Ich würde die Schneideffizienz in Frage stellen, da PCR-amplifizierte Produkte häufig Restriktionsenden haben und leicht in Vektoren kloniert werden können.
Vielleicht hängt es davon ab, wie weit Ihre Primer entfernt sind, aber laut diesem NEB-Artikel benötigen Sie einige zusätzliche DNA-Sequenzen auf beiden Seiten der Schnittstelle für eine effiziente Spaltung neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/… Da Sie Ich habe nicht angegeben, dass ich den schlimmsten Fall angenommen habe, bei dem sich Ihre Schnittstelle ganz am Ende des verstärkten Produkts befindet.
Ja, normalerweise sind es 4 bis 5 bp ... meine "Double-Check"-Primer würden 500 bp von jeder Seite der RE-Stelle amplifizieren. Es sollte sich gut spalten lassen. Außerdem wären 1.000 bp gegenüber 500 bp sehr auffällig
Wird diese Strategie funktionieren, um das erfolgreiche Klonen eines DNA-Fragments in einen Plasmidvektor zu verifizieren?
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