Wie schlecht ist Ethidiumbromid in Ihrem Plasmid für Downstream-Anwendungen?

Ich möchte aus Fett gewonnene Stammzellen mit einem eigenen Klon transfizieren. Mein Problem ist, dass ich eine Menge Kontamination bekomme (nicht nur genomisch, sondern aufgrund der Natur der Technik, ich bekomme unerwünschte Produkte, die ich nicht loswerden konnte).

Also dachte ich darüber nach, ein Gel mit meinen Plasmid-DNA-Proben laufen zu lassen und meine gewünschten Banden zu reinigen. Ich weiß jedoch nicht, ob eine Kontamination mit Ethidiumbromid in meiner Probe ein Problem darstellen würde oder ob ein reguläres Gelextraktionskit sie beseitigen würde.

Nein, das ist absolut kein Problem. Und das EtBr wird man bei der Reinigung sowieso los.
Die Toxizität von Ethidium ist wahrscheinlich nicht so schlimm, wie Sie denken, sie verwenden es in einer Menge von etwa 1 mg/kg bei Rindern, um Infektionen durch Parasiten vorzubeugen.
Und ich sollte darauf hinweisen, dass es nicht effizient ist, aus Gel gereinigtes Plasmid direkt in einer Säugerzelltransfektion zu verwenden. Sie sollten eine größere Vorbereitung in Betracht ziehen. Wenn es sich um ein Problem mit falschen Plasmiden handelt, transformieren Sie Ihre Plasmidmischung in Bakterien, wählen Sie mehrere EINZELNE Kolonien aus und präparieren Sie sie, sequenzieren Sie sie und versuchen Sie es erneut.
Danke für eure aufschlussreichen Antworten! Um Benutzer 137 zu antworten: Ich kann mein Plasmid in Bakterien nicht erweitern, um ein größeres Präparat zu verwenden, da die OriR-Sequenz nach Induktion mit Arabinose aus dem Konstrukt herausgeschnitten und abgebaut wird. Das ist, was ich versuche zu bekommen: ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4144359 Nochmals danke
@Varekai Ich habe schon früher Minikreise verwendet, es ist ein Schmerz, aber Sie müssen wahrscheinlich zum Bakterienschritt zurückkehren und Ihr elterliches Minikreis-Plasmid in großem Volumen aufziehen und den Rekombinationsschritt durchlaufen, um die bakteriellen Elemente zu entfernen, dann Gigaprep das Plasmid. Wenn Sie keine 100%ige Konvertierung des elterlichen Plasmids in Minicircle erhalten, konsultieren Sie den Abschnitt zur Fehlerbehebung in Ihrem Handbuch und wiederholen Sie den Vorgang.

Antworten (1)

Die Reinigung und Isolierung von DNA-Banden durch Ausschneiden aus Agarosegel ist alltäglich (Lee et al ., 2012) . Der Reinigungsschritt nach dem Ausschneiden der Bande entfernt den größten Teil des EtBr und anderer Verunreinigungen. Siehe zB die Websites von Isogen und Sigma-Aldrich .

Referenz
- Lee et al. J VisExp (2012); 62 : e3923

Wie schlecht ist Ethidiumbromid in Ihrem Plasmid für Downstream-Anwendungen?
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