Wie präpariere und kloniere ich E. coli-DNA?

Ich suche nach einem Protokoll, um genomische DNA aus einer E. coli - Probe zu erhalten, damit ich einen kleinen Teil davon mit PCR in ein Plasmid klonen kann. (< 500 bp in diesem Fall).

Es scheint, dass OWW (Open Wet Ware) nur die Herstellung von fragmentierter DNA diskutiert. Bedeutet das, dass ich es zerschneiden muss, bevor ich davon klonen kann? Irgendwelche Hinweise wären wirklich dankbar.

Was ist OWW? Akronymerweiterung oder ein Link wären hilfreich.
Es ist ein Wiki zur Beschreibung von Konsensprotokollen und zur Organisation von Laborwebseiten: openwetware.org
@shigeta könnten Sie näher erläutern, was Sie mit Klonen meinen? Möchten Sie ein Fragment des E. coli-Genoms in ein Plasmid einbauen und das Plasmid dann für die Klonierung transformieren?
danke Mac - bearbeiten Kevin hinzugefügt. @ Mac Das stimmt - in diesem Fall möchte ich ein <500 bp-Segment aus dem Genom klonen und es in ein Plasmid wie pGLO einfügen.
Sucht noch jemand eine Antwort darauf? Die Phenol/Chloroform-Extraktion ist der Goldstandard. Und hier ist ein spezifisches Protokoll für genomische E. coli-DNA, das kein Phenol/Chloroform verwendet: bio.classes.ucsc.edu/bio105l/EXERCISES/DNA/genomic.pdf
Die Antwort, die ich von einem Kollegen erhalten habe, lautet, dass man zur PCR aus einer Bakterienprobe Bakterien direkt in das PCR-Röhrchen geben kann, ohne es überhaupt zu lysieren. Vielleicht ist das so offensichtlich, dass niemand daran gedacht hat, das zu sagen ...
@shigeta Oh ja, das mache ich oft beim Screening von Kolonien nach einer Ligation / Transformation. Mit einem Zahnstocher eine Kolonie aufstechen, etwas Wasser einrühren, das Wasser für die PCR verwenden. Ich erhöhe den ersten 95°C-Schritt eines PCR-Protokolls von 2 min auf 4 min. Diese Reaktionen sind jedoch nicht die saubersten - wenn Sie ein Gen für das nachgelagerte Klonen amplifizieren, würde ich trotzdem empfehlen, zuerst die DNA zu reinigen.

Antworten (2)

Ja, Sie müssen das Genom fragmentieren, um es zum Klonen in einen Vektor einzufügen; Sie können nicht das gesamte 5-Mbp-Genom von E. coli in einen Vektor "einfügen". Es ist schwierig, Zellen mit riesigen Plasmiden zu transformieren, 2-20 kbp ist ein optimaler Bereich. Wenn Sie einen Klon des gesamten Genoms wünschen, warten Sie auf jeden Fall 30 Minuten, und die Zelle wird Ihnen gerne den Gefallen tun.

Die meisten Verfahren, die genomische DNA isolieren, werden sie zunächst fragmentieren, da sie viel zu groß und zerbrechlich ist, um zusammenzuhalten, und wenn dies der Fall wäre, würde der Großteil in anderen Zelltrümmern hängen bleiben und verworfen werden. Das Vortexen mit Glasperlen ist ein typischer erster Schritt, um es zufällig zu fragmentieren. Danach können Sie die DNA und Ihren Vektor verdauen, um passende Enden darauf zu platzieren, sie zu ligieren und Wirtszellen zu transformieren.

Wenn Sie einen gezielten Ansatz wünschen (um ein bestimmtes Gen zu extrahieren, eine Technik, mit der ich nicht vertraut bin), können Sie möglicherweise PCR auf Ihre extrahierte, fragmentierte DNA anwenden, da es hoffentlich ein intaktes Segment geben würde, das das Gewünschte überspannt.

Um ein bestimmtes Gen zu klonen, müssen Sie PCR-Primer entwerfen, die das Gen amplifizieren und auch mit spezifischen Restriktionsstellen, die Ihr Gen flankieren. Die Restriktionsstellen sollten den im Polylinker Ihres Plasmids gefundenen Restriktionsstellen entsprechen. Verdauen Sie für die Ligation Ihr Plasmid, behandeln Sie es mit CIP (um den Vektorhintergrund zu reduzieren) und ligieren Sie es mit Ihrem gereinigten und verdauten PCR-Produkt. Unnötig zu erwähnen, dass dies wahrscheinlich eine zu stark vereinfachte Erklärung des Klonens ist; lassen Sie mich wissen, wenn Sie weitere Einzelheiten wünschen.
@JamesPan Ich habe Gene zwischen Vektoren subkloniert, ich wusste nur nicht, ob es Unterschiede zwischen Vektor-> Vektor und Genom-> Vektor gibt. Es ist alles DNA, also gibt es theoretisch nichts Neues, aber ich weiß nichts über die praktischen Überlegungen.
Ich dachte, Klonen bedeute, ein Fragment des Genoms zu PCRn - ich habe noch nie daran gedacht, die Genomfragmente direkt in ein Plasmid zu stecken - man müsste viel genomische DNA haben, um dies zu tun - klingt hart.
@NickT Ich denke, Genom -> Vektor sollte immer noch das gleiche allgemeine Prinzip sein. Das Amplifizieren von Genen aus genomischer DNA sollte immer noch einfach sein (ich amplifiziere die ganze Zeit Gene aus menschlicher DNA). Ich finde, dass es manchmal, zumindest bei menschlicher DNA, pingelig werden kann, also probiere ich verschiedene PCR-Zusätze wie DMSO oder Betanin aus. Verwenden Sie ~50 ng genomische E. coli-DNA für Ihre Vorlage, amplifizieren Sie, erhalten Sie Ihre Produkte und fügen Sie sie wie alles andere in einen Vektor ein.
@JamesPan Sie können gerne eine weitere Antwort posten. Ihre Erfahrung und Ihr fundiertes Wissen scheinen besser zu sein als meine. Je mehr Antworten, desto besser.
Ich habe das Gefühl, Sie sagen mir, wie man etwas von genomischer DNA PCR entfernt, während ich auf ein Protokoll hoffe, um die chromosomale DNA zu reinigen, um sie durch PCR zu kopieren ...

Hey zusammen, ich glaube, ich wusste nicht, wie ich diese Frage richtig formulieren sollte. Nachdem ich einen Kollegen gefragt hatte, wurde mir gesagt, dass ich die DNA für dieses winzige Nicht-Bibliotheks-Szenario überhaupt nicht präparieren muss.

Sie sagte mir, ich solle einfach einen kleinen Bakterienabstrich auf einem Zahnstocher nehmen und ihn mit dem Mastermix und dem Enzym in die PCR-Reaktion geben, und die Heizzyklen würden den Rest erledigen.

Vielleicht war diese Frage zu einfach - sorry, wenn es so war.

(Natürlich hat es gut funktioniert.)

Wie präpariere und kloniere ich E. coli-DNA?
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